落羽杉属(Taxodium Rich.)树木包括落羽杉(T. distichum)、池杉(T. ascendens)和墨西哥落羽杉(简称墨杉) (T. mucronatum) 3个种，原产北美和墨西哥。该属树种均具速生、耐水湿、主干通直、树形优美和适应性广等特点，是生态林、用材林和园林绿化优良树种之一(陈永辉等, 1987, 南京中山植物园研究论文集, pp.92-97)。

落羽杉属树木的3个种在外部形态上表现出较大的差异，墨杉为半常绿乔木，且具有较强的耐盐碱性，落羽杉和池杉为落叶乔木，但落羽杉的叶呈扁平羽状，而池杉的叶为钻形。通过遗传差异大的落羽杉属树木进行种间杂交，对拓宽落羽杉属植物的遗传基础具有重要意义。江苏省中国科学院植物研究所从1973年起开展了落羽杉属种间杂交试验和速生耐盐碱类型的选育，育成了耐盐碱、速生、观赏价值高的‘中山杉302’(落羽杉×墨杉)和‘中山杉118’ (‘中山杉302’×墨杉)等一批国家级审定良种无性系(於朝广和殷云龙, 2010)，中山杉302和118在江苏、上海、浙江和山东等沿海省市以及安徽、重庆和云南等内陆省市得到大面积推广。2004年，该所又进行了墨杉(♀)×落羽杉(♂)杂交育种方法研究(殷云龙等, 2010, 墨杉(♀)×落羽杉(♂)杂交育种方法, 中国专利, ZL200710025662.4)，共获得中山杉405等11个杂交无性系，其中的中山杉405、406、407和502于2010年12月28日获国家林业局新品种权，其树高和胸径的生长量以及耐盐碱能力较亲本均有显著提高。

随着人们对中山杉利用价值的不断认识，其推广应用规模迅速扩大。对已获得的来自不同杂交组合的杂交后代的遗传变异情况及其亲缘关系进行研究，对其进一步的杂交育种和良种推广应用具有重要的意义。随着杂交育种工作的开展，前期已通过形态学(陈永辉等, 2006; 杨美凌等, 2010)、同工酶标记(尹晓明等, 2002)和RAPD分子标记(李涵等, 2007)对落羽杉属的3个种及其所获得的部分杂种的遗传变异情况进行了初步研究。如今又获得了一些新的优良杂交后代，有必要对所获得的所有优良后代的亲缘关系及其遗传变异情况做进一步的研究。

序列相关扩增多态性标记(sequence related amplified polymorphism, SRAP)是由Li和Quiros (2001)开发的一种基于PCR的新型分子标记技术。其原理是利用独特的引物设计对ORFs (open reading frames, 开放阅读框架)进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。该技术具有操作简便、过程快速、引物设计简单以及多态性和信息量丰富的特点，自开发以来已在植物的遗传多样性(昝逢刚等, 2009; 范彦等, 2010)、植物遗传图谱构建(林忠旭等, 2003)、基因连锁标记的寻找与基因定位(陈碧云等, 2006)等领域得到较为广泛的应用。於朝广等(2009)首次将SRAP分子标记技术应用到落羽杉属树木的研究中，结果表明SRAP分子标记技术可以有效地应用于落羽杉属树木的杂种鉴定及其遗传多样性研究中。本研究利用SRAP技术对落羽杉属3个种及其变种和杂交后代进行分析，一方面明确它们之间的亲缘关系，另一方面构建其指纹图谱，对不同品种及无性系进行鉴定，为今后育种及新品种保护与开发利用提供参考。

1结果与分析
1.1 25份落羽杉属植物的SRAP多态性分析
选用已筛选好的61对带型清晰，多态性较好的SRAP引物，对25份落羽杉属3个种及其变种和杂交后代进行扩增，得到的扩增产物的分子量在50~1 000 bp之间，61对引物共扩增出439个清晰的标记位点，其中多态性位点数为356个，多态性比率为81.09%。平均每对引物扩增得到的位点数为7.2，最多的为12条，最少的为3条，平均多态位点数为5.84，不同引物扩增的多态位点百分率差异较大，最高的为100%，最低的为33.33% (表1)。这些结果表明落羽杉属不同树种及其杂交后代间在DNA水平上存在广泛的遗传变异，同时也反映出SRAP标记在检测落羽杉属基因组遗传多态性上有较显著的检出效率。

表1 61对SRAP引物组合及其扩增结果

1.2 25份落羽杉属植物的亲缘关系分析
1.2.1遗传相似性分析
应用NTSYS-pc (2.1)软件，通过扩增谱带的1，0原始数据矩阵，对25份材料进行遗传相似性分析，供试材料间遗传相似系数(GS)的变异范围为0.498 6~ 0.807 6，平均遗传相似系数为0.646 1，样本间平均遗传距离(GD)为0.353 9，遗传相似系数的变异范围体现了参试材料间丰富的遗传变异，同时通过遗传相似系数也可以看出落羽杉属3个种及变种和不同杂交组合的杂交后代间的亲缘关系，25份种质间既存在遗传相似系数较高，亲缘关系较近的材料，也存在遗传相似系数较低，遗传距离较远的材料。

根据供试材料间的遗传相似系数(表2)，对不同参试材料间的相似系数(GS)进行了比较分析，分析结果表明，落羽杉、池杉和墨杉这3个树种之间的遗传距离都较远，遗传差异较大，墨杉和落羽杉的遗传相似系数为0.573 5，墨杉和池杉的遗传相似系数为0.528 4，落羽杉和池杉的遗传相似系数为0.551 0。落羽杉的2个栽培变种‘Pendens’和‘Fastigiata’的遗传相似性较高，遗传相似系数为0.704 9，而与落羽杉的遗传相似系数分别为0.567 0和0.627 5。中山杉302与墨杉杂交的11个杂交后代间的遗传相似性都较高，遗传相似系数的变异范围为0.615 8~0.798 7，其中遗传相似性最高的为中山杉118与中山杉136，这一组后代中，中山杉102与其它后代的遗传距离最大，与其它后代的遗传相似系数变异范围为0.615 8~0.664 7，这11个后代与母本中山杉302的的遗传相似数都较高，变异范围为0.690 0~0.794 4，与父本墨杉的遗传相似系数变异范围为0.594 2~0.785 3。墨杉与落羽杉杂交的一组杂交后代中山杉405、406、407、501、502和503的遗传相似性都较高，遗传相似系数的变异范围为0.661 7~0.807 6，平均为0.749 8。从遗传相似系数来看，中山杉407、502和503与母本的遗传相似性高于父本，而另3个后代与双亲的相似性基本相当。

表2 供试样本间的遗传相似系数

1.2.2聚类分析
从聚类图(图1)可以看出，落羽杉与墨杉的一组杂交后代首先在相似系数0.755处聚在了一起，又和池杉与墨杉的杂交后代中山杉401在相似系数0.689处聚为一类，中山杉302与墨杉的一组杂交后代在相似系数0.692处聚为一类，然后这3个杂交组合的后代又在相似系数0.682处聚为一大类，从遗传背景来看，这一大类材料均具有墨杉或落羽杉的遗传基因。2份来自美国的落羽杉变种聚为一类，池杉单独聚为一类，与其它材料的遗传距离较远。从聚类结果来看，同一个杂交组合的后代亲缘关系较近，基本上都聚在了一起，如中山杉302与墨杉的杂交后代中，中山杉1、27、86、118、136、140和146均与两亲本聚在一起，其中中山杉146与母本中山杉302最先相聚，亲缘关系最近，而中山杉140与父本墨杉最先相聚，亲缘关系更接近于父本。墨杉与落羽杉的杂交后代中的6个后代，有5个聚在了一起。从聚类图可以看出，虽然同一杂交组合的后代基本上聚在了一起，但也出现了一些与亲本基因型差异较大的后代，如中山杉302与墨杉的杂交后代中的中山杉46、102和149都单独聚为一类，而中山杉149却与池杉栽培变种‘Nutans’聚在了一起，与其它后代的的遗传距离较远。
 

图1 25份材料SRAP聚类图

1.3 25份落羽杉属植物的SRAP指纹图谱构建
根据61对SRAP引物的扩增结果，从中筛选出可以将参试的25份落羽杉属植物区分的引物组合，结果发现Me1Em7等23对引物扩增出一些特异性标记(表3)，表现为某一位点带的缺失或出现，可以单一地将中山杉9等共16个品种与其它品种区分开来，可作为鉴别这些品种的特异性标记。

表3 鉴别16个落羽杉植物品种的特异性标记

从扩增带型来看，61对引物中没有1对引物可以单独地鉴别所有参试落羽杉属植物种质及其后代，但是通过部分引物的两两组合可以有效地将其鉴别开来，这样的组合共有34个，从中选择1个带型最清晰又容易统计的组合对Me20Em8-Me11Em9 (图2)，用于构建25个落羽杉属植物的指纹图谱(表4)。
 

图2 引物Me20Em8 (A)和Me11Em9(B)对25份落羽杉属植物的扩增图谱

表4 引物Me20Em8和Me11Em9构建的25份落羽杉属植物的指纹图谱

2讨论
本研究应用SRAP分子标记技术对落羽杉属植物3个种及其变种和杂交后代共25份材料的遗传变异进行分析，61对引物共扩增出439个清晰的用于遗表4引物Me20Em8和Me11Em9构建的25份落羽杉属植物的指纹图谱传变异分析的标记位点，其中多态性位点数为356个，多态性比率为81.09%，从分子标记的角度进一步说明这25份材料间存在着丰富的遗传变异，这与前期从形态标记和同工酶标记的研究结果是一致的(陈永辉等, 2006; 杨美凌等, 2010; 尹晓明等, 2002)。

根据SRAP分子标记的分析结果，对25份参试材料进行了聚类分析和遗传相似性分析，结果发现同一个杂交组合的后代亲缘关系较近，基本上都聚在了一起，落羽杉与墨杉的一组杂交后代首先聚在一起，中山杉302与墨杉的一组杂交后代聚在一起，因这两个组合均具有落羽杉与墨杉的遗传基因，最后又在遗传相似系数0.682处聚在了一起。这样的聚类结果说明基于SRAP分子标记的亲缘关系分析与系谱关系基本一致，但也出现了一些与亲本基因型差异较大的后代，如中山杉9、中山杉102与中山杉149均单独聚为一类，与同一杂交组合的其它后代遗传距离较远。从聚类图上可以看出，池杉单独聚为一类，墨杉与和落羽杉分别与其一个后代聚在一起，落羽杉的2个栽培变种‘Pendens’和‘Fastigiata’聚在一起，亲缘关系较近。杨美凌等(2010)以外部形态特征的10项定性指标和5项定量指标为依据，对这些材料进行了聚类分析，结果也表明同一杂交组合的后代基本上聚在了一起，中山杉9也单独聚为一类，落羽杉的2个栽培变种聚在一起，这些结果均与本文的研究结果一致。而中山杉102与401聚在一起，中山杉149与136聚在一起，池杉和其栽培变种‘Nutans’聚在了一起，这些结果与本文的结果不一致，这从形态和分子标记两个方面说明了中山杉9确实是一个遗传变异较大的杂交后代，可能是在杂交育种过程中由于基因重组产生的新的基因型，至于中山杉102和149与其它后代间的亲缘关系，以及池杉和其变种之间的亲缘关系在形态和分子标记方面研究结果存在差异，一方面可能是因为形态观测受环境影响，以及形态指标的局限性有关，另一方面也可能是受SRAP分子标记为非特异性标记，以及标记数量的限制，结果也有局限性，这些结果还有待于在以后的研究中进一步加以验证。

虽然落羽杉属植物的3个种形态差异明显，但是3个种之间的杂交后代从形态上很难将其加以区分，本研究在前期工作的基础上，应用已筛选好的SRAP分子标记，对25份落羽杉属植物的亲缘关系进行研究，并从分子标记的角度构建这些后代的指纹图谱，结果发现，25份参试材料中，有16份材料可通过一些特异性标记有效地与其它材料区分开来，其余的9份材料和这些具有特异性标记的材料均可以通过依据不同引物构建的指纹图谱加以区分，指纹图谱的构建为这些杂交后代的开发与应用及其专利保护提供了有效的科学依据。这些结果也进一步证明了SRAP分子标记技术在落羽杉属植物亲缘关系研究以及品种鉴定中的有效性。

3材料与方法
3.1材料
试验材料为落羽杉属3个种(墨杉、池杉和落羽杉)、墨杉(♀)×落羽杉(♂)的6个杂交后代(中山杉405、406、407、501、502和503)、落羽杉(♀)×墨杉(♂)的1个杂交后代(中山杉302)、池杉(♀)×墨杉(♂)的1个杂交后代(中山杉401)、中山杉302(♀)×墨杉(♂)的11个杂交后代(中山杉1、9、27、46、86、102、118、136、140、146和149)以及从美国引种的1个池杉栽培变种('Nutans’)和2个落羽杉栽培变种('Pendens’和'Fastigiata’)，总计25份材料，均取自南京中山植物园种质资源圃。材料名称及其编号见表5。

表5 材料名称及编号

3.2 SRAP分析
基因组DNA提取采取CTAB (cetyltrimethy- lammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化胺)法。DNA质量采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，方法参照於朝广和殷云龙(2009)。SRAP反应引物为已筛选好的由17条正向引物和5条反向引物组合成的61对SRAP引物组合(表6) (於朝广等, 2009)，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。扩增反应采用优化后的10 µL SRAP-PCR反应体系(於朝广和殷云龙, 2009)。SRAP-PCR扩增程序参照薛丹丹(2008)。扩增反应在英国TECHNE公司的TC-412型PCR仪上进行。扩增结束后，采用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳结束后快速银染检测。

表6 SRAP引物序列

3.3实验数据的统计与分析
对供试25份材料扩增的电泳谱带中的清晰条带的总数和多态性带的数目进行统计。根据各多态性引物扩增条带的有无，按有带的记为“1”，无带的记为“0”，建立原始数据矩阵。根据条带的统计结果计算多态带数、多态位点百分率。利用NTSYS-pc (2.1)分析软件，计算遗传相似系数(genetic similarity, GS)，获得遗传相似系数矩阵。采用非加权配对算术平均法(unweighted pair group method using arithmetic averages, UPGMA)建立供试材料的树状聚类图。

作者贡献
於朝广负责DNA提取与电泳、统计分析以及论文撰写。殷云龙负责育种、指导实验和数据分析、论文修改。徐建华负责试验材料管理、协助DNA提取与电泳。

致谢
感谢江苏省高技术(农业)研究项目(BG2007318), 国家林业局植物新品种保护办公室植物新品种测试指南及已知品种数据库项目(2007010)和江苏省林业三项工程项目(lysx200947)对本研究的资助。感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

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