提取植物组织中总RNA是对植物分子生物学方面进行研究的必要手段。高质量的总RNA可进行RT-PCR、Northern杂交分析、基因克隆、cDNA文库的建立以及转录组测序等后续试验。植物组织中所含有的RNase、多糖、未知的次级代谢物、酚类化合物以及蛋白在细胞破碎前互不影响，在破碎后则与RNA相互作用导致RNA降解、丢失或抑制后续酶促反应(李宏和王新力, 1999)。不同植物组织中的蛋白质、多糖、酚类和脂类等成分的含量有较大差异(张洋等, 2010)，因此从不同材料中提取总RNA难度不同，适宜的总RNA提取方法也不尽相同。

大豆叶片和花总RNA提取难度相对较大，相关研究报道较少。付畅等(2004)对大豆不同器官总RNA提取进行了比较，结果表明应用异硫氰酸胍法和改良异硫氰酸胍法对大豆根、茎等器官总RNA提取效果较好，但对叶片总RNA提取效果不佳。刘易科等(2006)利用改良TRIzol法用于大豆根、茎、叶及生长点总RNA的提取，取得了较好的实验效果，而改良异硫氰酸胍法则无法用于大豆叶片总RNA提取。目前针对大豆花器官总RNA提取方法还未见报道。

本研究比较了植物总RNA提取试盒剂法、改良CTAB法和改良热硼酸法对大豆叶片和花总RNA提取效果，从中筛选出适合大豆叶片和花两种器官总RNA提取最佳方法。将提取获得的总RNA应用于基因克隆及荧光定量PCR等实验，以验证该方法所提取的总RNA能否满足下游分子生物学实验，为大豆基因工程研究奠定实践基础。

1结果与分析
1.1大豆叶和花总RNA提取
采用3种方法分别对大豆叶和花器官进行总RNA提取，分别为植物总RNA提取试盒剂法、改良CTAB法和改良热硼酸法。结果表明：3种方法均可提取出大豆叶和花总RNA，但提取总RNA的含量不同。其中改良热硼酸法提取的总RNA含量最高(表1)，叶片中总RNA含量为869.5 μg/g，花中总RNA含量为124.16 μg/g，该方法所获得的总RNA含量约为其他两种方法的6倍。3种方法提取的总RNA在OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.98~2.1之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值在0.12~2.37之间。尽管植物总RNA提取试剂盒法所提取的总RNA的18S、28S rRNA条带清楚，但含量较低且有DNA残留(图1A)。改良CTAB-LiCl法提取的总RNA出现拖尾情况，不能够清晰的分辨出18S、28S rRNA条带，所得总RNA完整性较差，有明显的降解(图1B)。改良热硼酸法所提取总RNA无拖尾现象，且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条带亮度的2倍(图1C)。

表1 不同方法提取大豆两器官总RNA的含量及质量 Table 1 Quality and concentration analysis of extracted total RNA from leaves and flowers in soybean

图1 两种器官提取总RNA电泳结果 Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA extracted from leaves and flowers in soybean

1.2 GmZAT9-like基因克隆及分析
为确定改良热硼酸法提取大豆叶、花两种器官的总RNA能否满足下游分子生物学实验。以该法提取总RNA反转录的cDNA为模板，RT-PCR扩增GmZAT9-like基因片段，结果成功扩增出约1 kb左右的特异片段(图2)。经测序，获得885 bp的核酸序列，与NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中所登录的Glycine max zinc finger protein ZAT9-like (登录号: XM_003517371.1)基因核酸序列同源性达99% (表2)，序列比对结果表明该基因在第158碱基处有一个位点发生变异(T→C) (图3)。

图2 GmZAT9-like基因的克隆 Figure 2 The results of GmZAT9-like gene cloning

表2 GmZAT9-like基因序列BLAST比对结果 Table 2 The BLASTn results of GmZAT9-like gene sequence

图3 GmZAT9-like基因序列比对结果 Figure 3 The BLASTn results of GmZAT9-like gene sequence

1.3 H3基因实时荧光定量PCR分析
实时荧光定量PCR技术对总RNA的纯度有很高的要求，为进一步确认所提取的总RNA的质量，我们利用实时荧光定量PCR对H 3基因进行了表达分析。结果表明：基因扩增的融解曲线图(图4)，出现了一个明显的峰值，同时扩增曲线具有明显的3个阶段，说明该荧光定量PCR实验所用引物、体系以及模板合适。

图4 实时荧光定量PCR检测Histone 3基因的融解曲线及扩增曲线 Figure 4 The melting and amplification curves of Histone 3 gene were detected by real time PCR

2讨论
大豆叶中富含大量多糖、蛋白和酚类化合物，花中含有大量色素类物质。这些杂质及其它次级代谢物等，严重干扰大豆叶及花总RNA提取(Louime et al., 2008)。由于这些物质与RNA共沉后形成难溶物，很难从总RNA中再次分离出来，降低了总RNA在水中溶解度；不溶物或杂质干扰RNA的紫外吸收值，并可抑制后续的各种酶促反应(夏海武等, 2006; Schneiderbauer et al., 1991)。因此有效去除多糖、蛋白和酚类化合物及干扰RNA提取的其它代谢产物就能够提高对大豆叶、花总RNA的提取质量。

植物总RNA提取试剂盒法，具有操作简单、提取时间短的优点。但针对本研究中大豆叶和花的总RNA提取效果不理想，可能原因为试剂盒中的提取液对大豆叶片和花的组织裂解不够彻底，没有有效的去除多糖、蛋白和酚类化合物，从而导致了总RNA的得率降低。且在纯化柱上消化DNA时不够彻底，导致DNA的残留，因此无法进行后续的分子生物学实验。而改良CTAB法中前期加入β-巯基乙醇，可有效的改善酚类物质的氧化，降低对RNA提取的干扰。但此法需要高温振荡下辅助裂解，高温使总RNA不稳定，出现轻微降解现象(任杰等, 2011)。改良热硼酸法相对属于一种温和的裂解方法，且在使用DTT和蛋白酶K后能够有效地抑制多糖、酚类以及其他影响RNA的次级代谢产物，将大豆叶和花的细胞内含物对总RNA提取影响降到最低。

由于大豆为油料作物，其叶和花中不但含有色素类物质，同时还有大量的油脂蛋白。针对材料的特殊性，利用改良热硼酸法的温和裂解特性，保证了总RNA的产量。且通过两次氯仿抽提，将叶绿素、花青素等色素类物质去除，同时氯仿进一步降低了蛋白的含量，减少蛋白及色素类物质对RNA的干扰，提高了总RNA的质量。

总之，与前两种提取大豆叶和花的总RNA方法相比，改良热硼酸法能够在保证产量及质量的同时，提高效率和降低成本，并能够满足RT-PCR、基因克隆及Real time RT-PCR等分子生物学实验的要求。这种提取方法及应用为大豆基因工程研究奠定了技术基础。

3材料和方法
3.1材料及试剂
实验材料为栽培大豆品种‘晋大74’(产地: 山西)，由山西农业大学农学院李贵全老师惠赠。2012年5月，种植于山西农业大学农作站试验田。大豆盛花期时，取顶端幼嫩叶片和花器官，经液氮速冻后置于-70℃的超低温冰箱中保存备用。所有无RNase试剂均购置于北京天恩泽公司。离心管等用品使用0.1%DEPC水处理并高温灭菌。

3.2大豆叶片总RNA 提取方法
3.2.1试剂盒法提取植物总RNA
采用康为世纪公司生产的植物RNA提取试剂盒(Cat. No: CW0559)，具体详细操作步骤请参见该产品说明书。

3.2.2改良CTAB法提取植物总RNA
提取液成分：2% CTAB(W/V)，4 PVP(W/V)，100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)，25 mmol/L EDTA (pH 8.0)，2 mol/L NaC1混匀灭菌120℃，15 min (胡根海和喻树迅, 2007)。

(1)称取100 mg的叶片组织，迅速放人液氮研磨呈粉末状，转入2 mL离心管内，加入预热65℃的提取液700 μL和300 μL的β-巯基乙醇，65℃温浴并震荡20 min。

(2)加入等体积的氯仿：异丙醇(24:1)混匀，4℃，10 000 r/min离心10 min。

(3)吸上清装入新的离心管里，加入1/4体积的10 mol/L LiCl混匀后，4℃冰箱过夜沉淀。

(4) 4℃，12 000 r/min离心10 min倒掉上清液沉淀晾干，加入100 μL无RNA酶水溶解。

(5)加入无RNase的DNaseⅠ于37℃恒温培养箱中消化RNA 30 min。

(6)加入等体积的氯仿抽提一次，4℃，13 000 r/min离心10 min。

(7)取适量上清液，-70℃超低温冰箱保存或直接进行后续试验。

3.2.3改良热硼酸法
提取液成分：200 mmol/L Na₂B₄O₇•10H₂O，25 mmol/L EDTA，1% (W/V)SDS，1% (W/V)脱氧胆酸钠，2% (W/V)PVP(MW 40 000)，0.5% Nonidet-40 (NP-40, PH 9.0)。

(1)将0.1 g叶片组织放入预冷的研钵中，液氮研磨，将粉状的组织放入DEPC预处理过的1.5 mL离心管中，加入1 mL预热至80℃的基本提取液，同时加入10 μL DTT (亚精胺, 1 mol/L)贮备液和40 μL蛋白酶K (20 mg/ml)贮备液。

(2)放置于42℃摇床中100 r/min温和混匀1.5 h。将混匀后的离心管中加入80 μL KCl (2 mol)，冰上放置1 h。

(3) 12 000 r/min离心20 min，取900 μL上清液，尽量取上清，可以减少体积，加入1/3上清体积的10 mol/L LiCl，将离心管上下颠倒几次，放置于4℃冰箱过夜(至少8 h)。

(4) 12 000 r/min离心20 min，弃掉上清，沉淀用2 mol/L LiCl (4℃预冷)洗2~3次，直到上清液为无色。

(5)加入400 μL的10 mmol/L Tris-HCl (PH 7.5)悬浮沉淀，将沉淀完全溶解，加入等体积的氯仿，混匀后12 000 r/min离心10 min，将上清液转移到另外一只新的离心管中。

(6)加入1/10体积的2 mol/L KAC (PH 5.5)，颠倒混匀，放置于冰上，冷却至0℃。

(7) 15 000 r/min 离心10 min，转移300 μL上清液，注意不要吸上管底杂质。

(8)加入750 μL冰冷的无水乙醇，–70℃冷冻1 h。15 000 r/min离心10 min。

(9)用70%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，再加入无水乙醇洗涤RNA沉淀，12 000 r/min离心5 min后，弃掉液体。

(10)放置于超净台中自然风干5 min，用无RNA酶水溶解RNA沉淀。

(11)加入无RNase的DNaseⅠ于37℃恒温培养箱中消化RNA 30 min。

(12)加入等体积的氯仿，混匀后12 000 r/min离心10 min。

(13)取适量上清液，-70℃超低温冰箱保存或直接进行后续试验。

3.3大豆叶片总RNA完整性及纯度检测
RNA完整性采用1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测(上样量为5 μL)，紫外凝胶成像系统观察并拍照；纯度及含量则采用e-spect蛋白核酸分析仪检测(上样量为1.5 μL) (肖旭峰等, 2011)

3.4基因克隆
以质量较好的大豆叶片和花总RNA为模板，使用Prime Script® RT Master Mix (TaKaRa, Code: DRR036S)试剂盒反转录成cDNA第一链。根据NCBI数据库中已报道的大豆GmZAT9-like (GenBank登录号: XM_003517371)基因序列设计特异引物(上游引物序列: ATGGAGCGGTACAAATGCA; 下游引物序列: AGTAATTATCAGGCATCAGAAAC)，RT-PCR反应体系建立：1 μL cDNA为模板，2 μL 10×Ex Taq Buffer (Mg²⁺ Plus)，1.6 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，补足纯水至总体积20 μL。特异目的条带经切胶回收纯化后，克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆送上海生工生物公司测序。

3.5 Real-time PCR检测内参基因表达
用Stratagene公司的Mx3000P荧光定量PCR仪对Histone 3基因(GenBank登录号: U38425.1)进行实时荧光定量PCR分析。上游引物序列：CAGACTGATCTGCGTTTCCA；下游引物序列：GTCCTCAAAGAGCCCAACAA。UltraSYBR Mixture检测试剂购置于北京康为世纪生物科技有限公司(CW0956A)。反应体系包括：10 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，2 μL cDNA，10 μL UltraSYBR Mixture (2×)和7.5 μL超纯水。反应条件为：95℃ 10 min (1个循环)；95℃ 15 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s (40个循环)。

作者贡献
郭彬和侯思宇是本研究的实验设计、实验研究和论文初稿的写作执行人，在本文中同等贡献，为共同第一作者；路阳及黄可盛完成数据分析；韩渊怀负责文章摘要部分的英文编辑；通讯作者王玉国是项目的构思者及负责人。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由山西省青年科技研究基金(2011021032-3)、山西省青年科技研究基金(2011021032-1)、山西农业大学创新基金(2010028)和山西省科技攻关项目(20120311005-3)共同资助。

参考文献
Li H., and Wang X.L., 1999, The difficulties in the isolation of RNA from plant tissues and their resolving strategies, Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Information), (1): 36-39 (李宏, 王新力, 1999, 植物组织RNA提取的难点及对策, 生物技术通报, (1): 36-39)

Zhang Y., Wang P.W., Yao D., and Zhang Z., 2010, Effects of extraction RNA from Soybean root under different developmental Stages, Anhui Nongye Kexue (Journal of Anhui Agricultural Sciences), 38(17): 8908-8909, 8912 (张洋, 王丕武, 姚丹, 张卓, 2010, 不同栽培及发育期对大豆根系RNA提取效果的影响, 安徽农业科学, 38(17):  8908-8909, 8912)

Fu C., Wang Y.Y., and Dai H.J., 2004, Analysis of RNA lation from different soybean srgas, Dadou Kexue (Soybean Science), 23(4): 281-284 (付畅, 王豫颖, 代红杰, 2004, 大豆不同器官中的RNA的提取分析, 大豆科学, 23(4): 281-284)

Liu E.K., Sun H.B., Jian B., Huo P., Gao X.W., 2006, and Hou W.S., 2006, Two efficient improved methods for isolation of high quality total RNA from Soybean, Xibei Nonglin Keji Daxue Xuebao (Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry (Natural Science Edition)), 34(12): 83-86 (刘易科, 孙洪波, 简波, 胡珀, 高小伟, 侯文胜, 2006, 2种大豆总RNA提取方法的改良, 西北农林科技大学学报(自然科学版), 34(12): 83-86)

Huo G.H., and Yu S.X., 2007, Extraction of high-quality Total RNA in cotton leaf with improved CTAB mthod, Mianhua Xuebao (Cotton Science), 19(1): 69-70 (胡根海, 喻树迅, 2007, 利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA, 棉花学报, 19(1): 69-70)

Louime C., Vasanthaiah H.K.N., Jittayasothorn Y., Lu J., Basha S.M., Thipyapong P., and Boonkerd N., 2008, A simple and efficient protocol for high quality RNA extraction and cloning of chalcone synthase partial cds from muscadine grape cultivars (Vitis Rotundifolia Michx.), European Journal of Scientific Research, 22(2): 232-240.

Xia H.W., Lv L.X., and Cheng G.X., 2006, New method for total RNA extraction in legume of Bauhinia Variegata, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 4(1): 147-149 (夏海武, 吕柳新, 陈桂信, 2006, 羊蹄甲果荚中总RNA提取的新方法, 分子植物育种, 4(1): 147-149)

Schneiderbauer A., Sandermann H., and Ernst D., 1991, Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds, Anal. Biochem., 197(1): 91-95
Ren J., Xu X.H., Zhang S.L., and Leng P., 2011, A method for effective isolation of total RNA from different plant tissues, Huabei Nongxuebao (Acta Agriculturae Boreali-Sinica), 26(S): 35-38 (任杰, 徐秀红, 张素丽, 冷平, 2011, 一种高效提取植物不同组织RNA的方法, 华北农学报, 26(S): 35-38)

Xiao X.F., Jiang W.X., Wu C.J., and Fan S.Y., 2011, Comparison of diferent methods for total RNA extraction from pueraia earthnut, Jiangxi Nongye Daxue Xuebao (Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis), 33(1): 147-150 (肖旭峰, 姜文轩, 吴才君, 范淑英, 2011, 野葛块根总RNA的不同提取方法比较研究, 江西农业大学学报, 33(1): 147-150)