从分子水平上研究群体的遗传结构特征，不仅可以了解群体遗传分化水平，同时也有利于遗传育种和优良群体遗传保护。线粒体 DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)与核 DNA 相比，碱基排列与堆叠方式相对简单，反映母系遗传特征，传代过程中变异速度较快，核苷酸发生转换或者颠换的频率较高等，mtDNA的这些独特之处使其成为鱼类群体遗传学研究中被众多研究人员广泛应用的重要标记方法(Oleinik et al., 2007; Teletchea, 2009)。mtDNA 基因组内不同区域的碱基替换呈现出不同规律和特征，适合应用于不同目标和层次群体遗传研究。在 mtDNA 上，控制区(D-loop)是整个 mtDNA 上序列和长度变异最大的区域(Lee and Kocher, 1995)，也是整个 mtDNA 基因组中进化最快的区域，通常适用于种内群体间遗传差异检测和分析，也有用于种间遗传差异分析的研究报道(郭新红等, 2004; 颉晓勇等, 2011)。细胞色素 Cytb 基因是蛋白编码基因，其进化速度与 mtDNA 其它区域相比较处于中间水平，适合种群间遗传差异的检测，是在 DNA 分子水平上分析生物种间和种内遗传变异的良好方法(Teletchea, 2009)。然而，有关 Cytb 和D-loop 序列遗传变异信息研究结果之间区别和联系的研究报道相对较少，特别是对于两种技术所得到的遗传变异数据之间关系所知无几。

吉富罗非鱼由上海水产大学引进中国之后，经历十余年时间的遗传改良，成为生产性状优良的养殖新品系(颉晓勇等, 2011)，对选育群体从分子水平上进行深入的遗传分析具有重要的意义。本研究开展了新吉富罗非鱼选育群体 mtDNA Cytb 和 D-loop 基因序列变异信息的对比分析，旨在探索 2 种 mtDNA 标记分析结果之间关系，目的是为了针对不同研究材料，选择不同的分析方法，以及扩大研究结果之间横向比较在分析技术上提供借鉴和参考，同时使得相关研究分析更加全面、研究结论更加客观。

1 结果与分析

1.1 基于 Cytb 与 D-loop 序列分析的群体内遗传多态性比率

本研究基于 Cytb 与 D-loop 序列分析得到的群体内遗传多样性比率结果(表1) 。根据 2 种方法得到的多态位点比率范围为 0.679 05~0.804 92，平均0.776 74；单倍型多样度比率处于 0.864 12~1.076 12之间，平均 0.919 45；核苷酸多样性指数比率处于0.713 77~0.884 49 之间，平均0.769 77；平均核苷酸差异数比率处于0.899 54~1.082 12 之间，均值为0.936 19。

1.2 Cytb 与 D-loop 序列中碱基转换率和颠换率

本研究 Cytb 与 D-loop 序列中碱基转换率和颠换率对比(表2)。Cytb 序列碱基转换率处于0.031 95~0.059 21 之间，平均 0.042 67；Cytb 碱基颠换率处于 0.002 82~0.005 48 之间，平均 0.004 10。D-loop序列碱基转换率处于 0.027 72~0.047 67 之间，平均 0.037 25；D-loop 碱基颠换率处于 0.015 52~0.027 72 之间，平均 0.02 284。

2 讨论

在遗传方式方面，mtDNA 以非孟德尔遗传方式控制和影响线粒体功能，与核基因不相一致。同时，鱼类 mtDNA 的碱基突变率高于核内 DNA，mtDNA损伤缺少有效的修复机制，特别需要指出的是有些 mtDNA 突变还存在累加效应，对 mtDNA 多态现象的量化分析表明两个无关个体之间 mtDNA 碱基平均相差 3% (郭新红等, 2004)。因此，对群体进行严谨的遗传变异特征分析时，有必要选择合适的 mtDNA 区域进行分析。有大量采用 Cytb、D-loop 或其它 mtDNA 基因区域进行分析的研究报道(Gerlach and Musolf, 2000; 陈善元和肖蘅, 2003; 于旭蓉等, 2011)。 mtDNA 不同区域的进化速率不同，采用 mtDNA 不同区域分析得到的序列遗传变异特征必然有所差异。但是目前对于 mtDNA 不同区域遗传得到的序列变异特征进行比较和量化分析的研究报道较少，当前分子标记相关研究多数停留于单种标记分析而缺乏不同种类标记之间横向分析，较大程度上限制了研究结果的参考价值，因而这方面仍有大量工作有待深入研究。

mtDNA序列碱基变异可以分为两种类型，转换(transition)是发生同种类碱基置换，即由嘌呤或者嘧啶发生同种类但不同碱基之间的置换；颠换(transversion)是发生不同种类碱基之间的置换，嘌呤置换嘧啶或嘧啶置换嘌呤，即发生嘌呤和嘧啶碱基之间的置换。本研究Cytb转换率平均0.042 67，Cytb 颠换率平均0.004 10；D-loop 转换率平均0.037 25，D-loop颠换率平均0.022 84。可以得到Cytb区域转换/ 颠换比值约为10.41，D-loop 区域转换/ 颠换比值约为1.66，转换率均大于颠换率，该结论与与其他的研究结果相一致(Gerlach and Musolf, 2000; 赵亮等, 2010; 杨慧荣等, 2012)。碱基置换在不同基因区域具有不同生物学功能，发生于编码多肽的基因区域(比如Cytb)，则可能改变密码子信息从而使得后续转录、翻译等相应改变，生物体中可能出现一种新的氨基酸结构取代相应位置原有的某一种氨基酸；碱基置换也可能使蛋白编码基因中提前出现终止密码，多肽链合成提前中断。这些碱基置换的结果都使得蛋白编码基因不能正确地形成原有的蛋白质，从而完全或者部分地失去某种生物学活性(贾若欣等, 2011, 畜牧与兽医, 43(9): 100-104)。本研究不同基因区域碱基转换率Cytb/D-loop约为1.15，不同基因区域碱基颠换率Cytb/D-loop约为0.18，推测该结果与Cytb 编码蛋白，而D-loop与mtDNA转录和复制过程中的调控作用有关。

DNA 双链中的不同区域具有不同突变频率，以及承受不同的进化压力，因而具有不同的进化速率，本研究也证实了这一结论。D-loop 区域的变异速率约为mtDNA 完整分子的5~10 倍(郑冰蓉等, 2002)。本研究尼罗罗非鱼5 个选育群体Cytb/D-loop 序列多态性比率结果表明，多态位点比率和核苷酸多样性指数Cytb 仅仅是D-loop 区域的0.776 74 和0.769 77，Cytb/D-loop单倍型多样度和平均核苷酸差异数比率略高，分别为0.919 45 和0.936 19，这一结果与控制区是mtDNA中不编码多肽链的核苷酸片段，无修复系统，不受选择压力的影响，因而积累了更多的变异(李鹏飞等, 2011)，而细胞色素b 基因编码蛋白因而进化相对较慢有关。总体来说，本研究对Cytb 和D-loop 区域序列变异信息的对比分析，有助于为其它类似研究扩大横向比较范围和更深入地理解单种Cytb 或D-loop 标记分析方法的研究结果提供参考。

3 材料与方法

3.1 实验材料

上海水产大学1994 年从菲律宾引进的5 000 尾尼罗罗非鱼(基础群体, F0)，从1996 年起开展选育，每年产生一代。本实验的材料是从F0、F6~F9 共5 代尼罗罗非鱼选育群体中随机采样各20 尾，剪取尾鳍，分别编号后以95%乙醇保存备用。

3.2 基因组DNA 提取和PCR 扩增

参照常规的酚- 氯仿抽提程序进行，并通过琼脂糖凝胶电泳初步检测所提取DNA质量。控制区引物序列参考Agnèse等(1997)，碱基序列为DL1: 5'-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3' 和DH2: 5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'。细胞色素b 基因引物参考彭作刚等(2005)，碱基序列为L14724: 5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3' 和H15915: 5'-CTCTCTCCGGATTACAAGAC-3'。PCR扩增反应体系为50 μL，包含10×Buffer 5 μL，dNTP 10 mmol，上游引物和下游引物各2 μL (10 pmol/μL)，模板DNA 200 ng，Taq DNA聚合酶2.5 U。PCR 扩增程序：94℃预变性设定4 min；94℃高温变性设定30 s，模板与引物适温条件下退火30 s，72℃引物聚合与延伸1 min，每次扩增程序包含35 个循环；最后72℃ 10 min；4℃保存。其中，控制区退火温度50℃，细胞色素b基因退火温度56℃。

3.3 DNA 测序

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，选择扩增效果良好的PCR 产物进行纯化，由上海sangon 公司用ABI 377 DNA 自动测序仪进行双向序列测定。

3.4 数据处理与分析

用BLAST 软件(Altschul et al., 1997)搜索Gen-Bank 中尼罗罗非鱼的控制区和细胞色素b 基因序列，与实验测定的尼罗罗非鱼相应序列结果进行比较；用Bioedit 软件(Hall, 1999)编辑基因测序结果，以CLUSTL W 软件(Thompson et al., 1994)重排序列和比较同源性，并辅以人工核对校正。用DNASP 软件(Rozas et al., 2003)统计分析。按Cytb/D-loop 分别计算由Cytb 和D-loop 2 种方法所得到的多态位点比率、单倍型多样度比率、核苷酸多样性指数比率和平均核苷酸差异数比率。按转换与颠换数占相应序列碱基总数比率计算转换率与颠换率。

作者贡献

颉晓勇是本研究的执行人，完成实验设计、数据分析、论文写作与修改，也是资助项目之一的负责人；李思发是另一资助项目的构思者和负责人。

致谢

感谢上海海洋大学为本研究提供罗非鱼种质材料。

参考文献

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