鉴于化石燃料的短缺和全球变暖等因素，人们日趋重视可再生和环保特点的生物能源的开发。生物柴油是生物能源中的一个重要组成部分，目前用于生物柴油炼制的农产品有大豆、油菜、花生、玉米、和麻风树等。其中，由微藻藻油提炼的生物柴油，由于其单位面积可提供最大的生物产量，而最具有吸引力(Deng et al., 2009)。

微藻，因只能在显微镜下才能辨别其形态而得名，通常是指含有叶绿素a 并能进行光合作用的微生物的总称。目前发现的微小类群藻类有两万余种，广泛分布于各种水体中。微藻能像植物一样利用光合作用将空气中的二氧化碳固定，转化生成油脂。更为重要的是它易于培养且生长速率快。因此比传统的林业、农业作物和其它水生植物在经济与时间成本考量上更具竞争力(Zhang et al., 1996)。虽然，微藻是替代石油的绝佳生物资源，但是并非所有的微藻都适合用于生产生物柴油，并且以目前的技术水平，微藻培养存在单位面积生产能耗大、投入成本高的问题，微藻生物柴油要真正成为一种替代能源，降低微藻的生产能耗和成本至关重要。这些问题的解决，一方面需要各环节技术的突破，另一方面也要依赖于优良藻种的筛选培养基的优化(Song et al., 2008; Zhang and Tang, 2008)。

本课题组从海南自然水体中分离了一藻株，经过形态和分子鉴定，并且在各种培养基中进行培养，以期选择出促使藻株大量积累中性脂的最适培养基；此外从藻株的含油量、总糖和总蛋白含量浅析其相互关系，为微藻生产生物柴油提供理论依据。

1结果与分析

1.1藻株经聚类分析鉴定为Micractinium sp. 18A8

藻株18A8DNA用作PCR的模板，经PCR扩增出约1 078 bp的片段。片段随后克隆进pMD18T载体中，测序。通过分析表明：藻株18A8与Micractinium sp. (TP-2008a)的18S rDNA基因的相似度为99.5%，因此，将它命名为Micractinium sp. 18A8。

1.2 Micractinium sp. 18A8 生长曲线和含油量比较

Micractinium sp. 18A8在SE、HSM、BG11、中生长良好。在HSM培养基中的生长最快。第10天生长速率为(0.41±0.02) g/L，显著高于BG11的速率(0.06±0.004) g/L和SE的速率(0.078±0.002) g/L (p<0.01)。而在-N、-P、-S培养时，Micractinium sp. 18A8的生长速率大幅降低。含油量检测是：Micractinium sp. 18A8在BG11 中为31.2%；在HSM中为23%；在SE中的含油量为21.7%。而HSM-N培养时，油脂含量为68%，相比HSM培养基油脂含量提高了196%；SE-N培养时，油脂含量提高了91%，BG11-N 培养时，油脂含量提高了123%。

硫元素缺陷条件下，HSM-S 培养时，油脂含量为58.1%，较HSM油脂含量提高了152% (图1)；SE-S培养时，油脂含量提高了129%；BG11-S培养时，含油量则提高了58%。Micractinium sp.18A8藻株在BG11-P、SE-P和HSM-P培养时，含油量分别提高了13%、57%和91%。由此认为：-P可增加藻株的含油量；-S和-N能显著地提高藻株含油量(图2)。

1.3 Micractinium sp. 18A8在-N、-P、-S培养基中组分及光合效率

将实验藻株接种到HSM-N、HSM-P和HSM-S中培养至第八天，测定其油脂、蛋白和糖含量。结果显示(表1)：Micractinium sp. 18A8 藻株在-N、-P、-S 培养基中含油量增加，而糖和蛋白的含量却下降。其中，在HSM-N 培养时蛋白的含量比HSM 降低了8.5%，糖的含量降低了51.4%；在HSM-S 时，糖的含量降低了53%，蛋白的含量降低43.6%；在HSM-P 时，糖的含量降低了40.5%，蛋白的含量减少31.9%。由此可以推断，缺陷培养细胞油脂含量的增加，主要来源于糖的减少和蛋白合成的减少。

对藻液的叶绿素含量及光和效率测定结果(表2)：HSM-N、HSM-P 和HSM-S培养，Micractinium sp. 18A8 的叶绿素含量显著降低，特别是在-S 或-N 的条件下，叶绿素a 的含量只为HSM 的4%或3.4%。微藻的光合效率也均低于对照，特别是在HSM-S 培养条件下，光合效率只有对照的43%。可见，缺陷培养时光合效率的下降造成微藻生长减慢。

1.4乙酸钠和葡萄糖在一定范围内随浓度增加促进Micractinium sp. 18A8 油脂积累

由于缺硫能诱导Micractinium sp. 18A8油脂的积累，而且外加碳源具有促进油脂积累的作用。为了得到最佳的碳源优化，本研究以乙酸钠和葡萄糖为碳源，以SE-S 为基础培养基，进行最佳含油量培养条件优化(图3)，当藻株养到第8天，培养基NaAc或葡萄糖的含量分别为30 mmol/L 或50 mmol/L时，Micractinium sp. 18A8 的生长和细胞含油量均达到最大值，此时，藻株的生长速率与含油量提高了733% 和73% (添加30 mmol/L NaAc)；而当培养基中葡萄糖为50 mmol/L 时，藻株的生长速率与含油量则分别提高了667%和280%。而当培养基中NaAc 或葡萄糖的含量分别超过30 mmol/L 或50 mmol/L，藻株的生长速率与含油量反而下降。由此可见，过高浓度的碳源将抑制藻细胞的生长和油脂积累。进而，对各培养条件下微藻的叶绿素和放氧量进行测定并计算光合效率。结果如表3所示。藻株叶绿素含量和光合效率在NaAc 不超过30 mmol/L 或葡萄糖不超过50 mmol/L范围内的随C 源浓度增加而升高，光合效率的变化趋势与藻株的生长速率与含油量的变化趋势基本一致。这说明外加碳源能在培养基中元素缺乏时对微藻的生长和光合效率起到积极的促进作用，也为解释其生物量和油脂含量的增加提供了证据。

2讨论

以微藻制备生物柴油已经日益受到人们的关注(Jia et al., 2006;Huang et al., 2008)。本研究对象Micractinium sp. 18A8 是课题组从海南分离的藻株，以前未见培养基优化等相关的报道。本文研究了N、P或S缺乏条件下，Micractinium sp. 18A8的生长和油脂积累状况。以及葡萄糖和乙酸钠对Micractinium sp. 18A8油脂和生长的影响，并测定了总糖、总蛋白、和光合效率等。实验结果表明，Micractinium sp. 18A8 在HSM高碳培养基的生长速率显著高于BG11 和SE 中的生长速率，说明较多的碳源有利于藻株生长。高碳培养中含有乙酸钠，微藻在进行光合自养的同时可以利用其进行异养生长。而当N、P 或S 元素缺乏时，Micractinium sp. 18A8 的生长显著受到抑制。这也是缺氮或缺硫培养尽管油脂含量提高，但由于生长缓慢，总的油脂产量不高的原因。由于葡萄糖或乙酸钠能够促进微藻的异养生长，故本研究进一步探索了在SE-S 培养条件下，添加不同浓度的葡萄糖或乙酸钠对Micractinium sp. 18A8 生长、含油量以及光合效率的影响。结果显示，当葡萄糖或乙酸钠的浓度分别为30 mmol/L 和50 mol/L 时，Micractinium sp. 18A8生长量、含油量以及光合效率达到最大。本课题组以往的实验表明碳源能促进一些藻株的生长，而科研人员在研究三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)时发现外加NaAC 有效促进了藻株的生物和含油量的提高(Fu et al., 2011)。赫冬梅等(2012)在研究葡萄糖和乙酸钠对湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)兼养600生长的影响时，发现随着葡萄糖和乙酸钠浓度的增加，等鞕金藻的生长和产物积累均表现出先促进后抑制的现象；葡萄糖和乙酸钠的最适浓度分别是15 g/L和7.5 g/L (He et al., 2012)。说明在元素缺乏情况下，添加碳源是提高微藻生物量和含油量一种可行手段，为微藻规模化培养提供了一个新视角。

3材料与方法

3.1藻株与培养基

藻株18A8采自海南，由划线法获得。本实验所用的HSM、BG11、SE及其氮、磷、硫缺陷培养基配方见蔡佳佳等(2011)，液体培养时以26℃、220 rpm、110 μmol•m^-2•s^-1光照、震荡培养。

3.2油脂的测定

参照周玉娇等的方法，制作三酰甘油含量标准曲线。以尼罗红给待测样品染色10 min，使用Promega发光检测仪测定样品荧光值(Zhou et al., 2010)。

3.3生物量的测定

参照蔡佳佳等(2011)的方法，用酶标仪藻液测定490 nm 波长吸光值；同时取藻液样品测定其干重，并制作标准曲线。

3.4藻株DNA的提取

采用改良玻璃珠法提取微藻基因组DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，通过紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度，并将DNA溶液稀释至50 ng/μL (Gu et al., 2011)。

3.5 18S rDNA基因片段的克隆及序列分析

PCR扩增18SrDNA片段，回收扩增产物，进行克隆，测序，通过NCBI搜索同源序列，聚类分析以MEGA软件进行。

3.6藻细胞蛋白，糖测定，叶绿素和放氧效率的测定

取10 mL对数生长期藻液，超声波破碎藻细胞，离心收集上清，参照辜博等的方法进行蛋白质和总糖测定(Gu et al., 2011)。

3.7藻细胞叶绿素和光合效率的测定

参照Deng等(2011)的方法测定叶绿素含量：待测藻液经处理后，测定其663 nm 和646 nm 吸光值，按以下公式计算叶绿素含量(Lichtenthaler, 1987)。

Chla=12.21 (OD663)-2.81 (OD646)

Chlb=20.13 (OD646)-5.03 (OD663)

式中：Chla、Chlb-叶绿素 a 和b 的浓度。

参照William (1993)方法进行光合效率的测定：以液相氧电极，测定藻液含氧量和氧气变化率。光合效率为光饱和时，相应的的放氧效率加上耗氧效率。

作者贡献

邓晓东负责实验的设计和操作；蔡佳佳协助部分工作；费小雯负责整个研究的设计、规划、和论文的撰写修改。

致谢

本研究由海南省工程技术研究中心专项：热带能源微藻新藻种培育及产业化研究(GCZX2011006)、海南省工程技术研究中心专项：利用紫外诱变技术选育优良微藻藻种及培养条件优化(GCZX2012004)和中央级公益性科研院所基本科研业务费：微藻油脂代谢网络的转录组研究(ITBBZX0941)共同资助，在此表示感谢。

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