介绍

新一代测序方法——高通量RNA测序(转录组)正越来越多地应用在植物的检测和定量已知或新型转录物的选择技术。这种转录组分析方法是快速和简单的，因为它不需要cDNA的克隆。这些cDNA的直接测序可以深度产生短reads。测序后，得到的reads可以组装成基因组规模的转录配置文件。它是一种更全面和有效的方法来测量转录组组成，获得RNA表达模式，并发现新的外显子和基因(Mortazavi et al., 2008; Wang et al.,2009)；使用各种装配工具，基因的功能注释和用各种生物信息学工具携带的途径分析来组装转录组的测序数据。本研究报告的大量转录本可以作为描述五种豆类物种的宝贵的遗传资源。

高通量短read测序是基因组学界公开的最新测序技术之一。例如，在Illumina基因组分析仪上的平均单次运行可以得到超过3000至4000万个单端序列(~35 nt)。然而，输出结果可以轻松超过为传统Sanger测序的长度设计的基因组分析系统，甚至获得较小体积数据的454(Roche)测序技术。通常，短read测序初期使用是局限于与参考基因组几乎相同的基因组数据的匹配。全基因表达水平的转录组分析全是短read测序的理想应用。传统上，这种分析包括互补DNA(cDNA)文库构建，EST的Sanger测序和微阵列分析。与传统的Sanger方法相比，新一代测序已经成为增加测序深度和覆盖范围，同时减少时间和成本的可行方法(L J Collins et al.)。

1方法

1.1序列检索

本研究的重点是五种豆科植物的de novo测序和序列注释，分别是来自NCBI数据库的花生SRR1212866，鹰嘴豆SRR627764，菜豆SRR1283084，葫芦巴SRR066197和豌豆SRR403901，花椰菜SRR1212866，Cicer arietinum L.的SRR627764，菜豆的SRR1283084的Phaseolus vulgaris L.，Trigonella foenum-graecum L. SRR066197和来自NCBI数据库的SRR403901的猕猴(Vicia sativa L.)，用于de novo转录组分析。从Illumina HiSeq 2000平台和LS454-454GS FLX平台来源的NCBI SRA中下载的原始数据(http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/)。使用NCBI的SRA TOOL KIT将原始序列转化为fastq文件格式用于进一步注释(http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=software)。

1.2 NGS QC工具包

NGS QC工具包，它是用于高质量数据的质量检查和过滤的应用程序。此工具包是一个独立的开源应用程序，可从http://www.nipgr.res.in/ngsqctoolkit.html免费获得。该工具包包括用Roche 454和Illumina平台生成测序数据的用户容易掌握的QC工具以及用于辅助QC(序列格式转换器和修整工具)和分析(统计工具)的附加工具。提供了各种选项便于用户定义的QC参数。该工具包预计对利于较好下游分析的NGS数据的QC非常有用(Patel RK, et al)。

1.3 通过CLC GENOMICS WORKBENCH 7进行De novo测序

用于分析，比较和下一代测序数据可视化的全面和用户容易掌握的分析包。这个软件包用de novo测序工具的默认参数对序列进行de novo测序(http://www.clcbio.com/products/clc-genomics-workb ench/)。

1.4 BLASTX

对测序文件进一步注释，第一步是从序列中鉴定出翻译的蛋白质序列。改变几个参数后在NCBI上进行BLASTX比对，如选择非冗余蛋白质数据库(nr)作为数据库；双子叶植物在生物选择和算法参数的最大目标序列设置为10，期望阈值设置为6。

1.5 Blast2GO

Blast2GO (http://www.blast2go.com/b2ghome)是一个用于(新)序列的功能注释和注释数据分析的ALL in ONE工具。基于蛋白质数据库注释的结果，Blast2GO被用于获得基于GO项的unigenes的功能分类。转录序列根据三个GO term分类，如分子功能，细胞过程和生物过程(Ness et al., 2011; Shi et al., 2011; Wang et al., 2010)。用WEGO(http：//www.wego.genomics.org.cn)工具对所有unigenes进行GO功能分类，并在宏观层面了解该物种的基因功能的分布。用KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)注释这些unigenes的途径。

1.6 SSR挖掘

我们使用MIcroSAtellite(MISA)(http：//pgrc.ipk- gatersleben.de/misa/)进行微卫星挖掘，统计输出其产生有用转录组的信息。

1.7植物转录因子

PlantTFcat：在线植物转录因子和转录调节因子分类和分析工具，用于鉴定序列中的植物转录因子(http://plantgrn.noble.org/PlantTFcat/)。

2结果与讨论

2.1序列比较

(表1)。

2.2 NGS QC工具包

通过去除衔接子和其他污染的材料用该工具过滤序列，然后用该工具检查序列的质量，最终用de novo序列组装的高质量过滤序列文件(表2)。

Table 1 Species comparison based on sequence

 

Table 2 NGS QC Toolkit Result

CLC GENOMICS WORKBENCH 7 考虑用于De novo序列组装，使用默认参数比如Mismatch Cost = 2, Insertion Cost = 3, Deletion Cost = 3, Length Fraction = 0.5, Similarity Fraction = 0.8, Word size = 21，由本软件产生的序列平均值和其他细节列于表3。

Table 3 Contig measurement in Length

2.4BLASTX和blast2GO的功能注释

2.4.1 BLASTX

使用10-6的E值阈值进行BLASTX以将序列与非冗余序列数据库比对。BLAST结果的各种统计信息列于表4。

Table 4 Blast Result comparison

2.4.2酶代码(EC)分类

表5是酶序列分类，进一步分为六类，氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶。

Table 5 Enzyme Code (EC) Classification

2.4.3基因本体(GO)分类

为了将各种豆科植物的转录序列进行功能分类， 分配GO terms组装转录序列。转录序列按照GO功能类别进行分组(http://www.geneontology.org)，其分布在分子功能，生物过程和细胞组分的三个主要类别(表6)。

Table 6 Gene Ontology (GO) Classification

图1是WEGO工具的输出结果; 它表明，在分子功能类别中，编码与催化活性相关的结合蛋白和蛋白质的基因是最富集的。与代谢过程和细胞过程相关的蛋白质富集在生物过程类别中。关于细胞成分类别，细胞和细胞部分是最高度表示的类别。我们发现在所有其他豆类种类相同，所以我们只用此图说明WEGO工具。

Figure 1 WEGO Tool Result of Arachis hypogaea L.

许多基因在KEGG数据库中用不同的途径注释(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。进一步的比较结果显示在表7中。许多转录物包括各种途径，如代谢途径，植物 - 病原体相互作用途径，脂肪酸代谢途径和脂肪酸生物合成。

Table 7 KEGG Result

2.5 SSR挖掘

微卫星标记(SSR标记)是构建花生遗传图谱和多样性分析中最成功的分子标记(Zhang et al)。为了鉴定SSR，用perl脚本MISA搜索所有转录物。表8描述了SSR挖掘结果，其显示了每个物种SSR结果的详细信息。最大部分的SSR是单核苷酸SSR，随后是三核苷酸SSR和二核苷酸SSR。虽然在转录物中只鉴定了一小部分四，五和六核苷酸SSR，但在大多数物种中该数目是相当显著的。

Table 8 Statistics of SSRs identified in transcripts

2.6植物转录因子

此外，通过与已知的转录因子基因家族的序列比较来鉴定转录因子编码转录物。表9中的结果显示，确定了转录因子基因分布在与家族中，并且表9和图2中描述的是Trigonella foenum-graecum L..的植物转录因子结果。转录因子编码转录物在各种已知蛋白质家族中的整体分布与早期预测的其他豆类非常相似(Libault et al., 2009)。

Table 9 Plant Transcription Factor Result

Figure 2 Plant Transcription Factor Result of Trigonella foenum-graecum L.

3结论

本研究侧重于NCBI数据库中五种不同豆科植物的de novo测序和分析，通过用新一代Illumina和454测序进行RNA-seq分析。转录组测序使得能够对生物体进行各种功能性基因组学研究。虽然已经开发了用于快速测序和表观转录组的几种高通量技术，但是表达的序列数据仍然不能用于许多生物体，包括许多作物植物。在这项研究中，我们对五种不同豆科植物进行了de novo功能注释，不考虑任何参考物种具有显着的非冗余集的成绩单没有考虑任何具有显着的非冗余集转录本的参考物种。根据五种植物数据的详细分析得到了几个重要的特征如GC含量，豆科植物和其他植物物种的保守基因，通过GO term区分功能类别和通过MISA工具鉴定SSR。值得注意的是，对Arachis hypogaea L., Cicer arietinum L., Phaseolus vulgaris L., Trigonella foenum-graecum L.和Vicia sativa L.这五种不同豆科植物的比较研究将有利于进一步的功能基因组研究，因为它包括每个物种完整注释的有用信息。

致谢

感谢Prof. (Dr.) P.V. Virparia, Director, GDCST, Sardar Patel University, Vallabh Vidyanagar为研究工作提供设备。

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