精原干细胞可以转化为类胚胎干细胞，而且具有多能性(Kanatsu-Shinohara et al., 2004; Guan et al., 2006; Seandel et al., 2007; Conrad et al., 2008; Kanatsu-Shinohara et al., 2008;Kossack et al., 2009)。精子发生是精原干细胞自我更新和分化从而产生精子的复杂过程，这个过程是数以千计的基因通过程序化的表达在特定阶段编码蛋白发挥特定的作用而完成的。特定基因独特的时空表达模式在调节精原干细胞早期发育及自我更新和分化过程中起着非常重要的作用。前人研究指出，大鼠出生7~8 d日龄，A型精原细胞是唯一的生殖细胞，因为B型精原细胞直到11 d才能发育形成(Dym et al., 1995; Fouchécourt et al., 2006)。本实验以大鼠为动物模型，在前期的研究工作中，E型钙黏连蛋白基因(Cdh1)在大鼠出生后睾丸组织的转录表达变化很大，Cdh1是精原干细胞标志性基因(Tokuda et al., 2007)，Cdh1 mRNA在出生后第2天、第4天和第6天保持较高的水平，在出生后第8天突然下降，在出生后第10天又开始升高(刘陶迪等, 2011)。也就是说，大鼠出生后第6天与第10天Cdh1 mRNA的表达都保持较高水平，第10天Cdh1 mRNA表达的再次升高是不是受到其它基因的调控，在这两个时间点睾丸组织其它基因的表达又有哪些变化呢？这些变化的基因与哪些生物学功能有关？这一系列的问题都有待回答。因此，我们选定大鼠出生后第6天与第10天的睾丸组织作为研究对象，对全基因组表达谱基因芯片数据进行初步的比较分析。

1结果与分析
1.1芯片杂交差异表达基因数据统计
我们通过基因芯片技术检测了大鼠出生后第6天与第10天睾丸组织的基因差异表达。第10天与第6天相比，表达水平相差两倍以上的基因共4 298个(图1)。这些基因参与了3 154个GO功能条目分析；参与了154个信号通路。差异表达上调的基因共1 878个，表达下调的基因共2 420个。差异表达的倍数相差2~36.4倍。差异表达相差8倍以上的基因有31个，6个基因表达上调，25个基因表达下调。其中，13个基因参与GO功能分析(表1)。分别与生物学过程，细胞组分和分子功能有关(表2)。

图1  10天龄与6天龄大鼠相差两倍以上的4 298个差异表达基因的散点图 Figure 1  The scatter plot of 4 298 genes with 2-fold or more differentially expressed in the rat testis tissues between the ages of 6 and 10 days

表1 差异表达相差8倍以上的13个基因 Table 1  13 genes with 8-fold differentially expressed in the rat testis tissues between the ages of 6 and 10 days

表2 差异表达相差8倍以上参与GO功能条目分析的基因 Table 2 Gene Ontology analysis of the genes with 8-fold differential expression

1.2实时定量RT-PCR验证
为了进一步验证基因芯片的结果，我们从基因芯片的结果中选择了3个差异表达的基因，LOC686076,Cxcl6和Trib3，做了实时定量RT-PCR检测。实时定量RT-PCR的与基因芯片的结果趋势一致(表3)。

表3  实时定量RT-PCR验证3个基因差异表达 Table 3 Differential expression of three genes validated by quantative real-time PCR

2讨论
在大鼠出生早期，睾丸内的生殖细胞除了有精原干细胞，还存在原生殖细胞(PGCs)和精原干细胞的前体，即生殖母细胞(Lacham-Kaplan et al., 2004; Forand and Bernardino-Sqherri, 2009)，大鼠出生第8天，除了精原干细胞的标志性基因Cdh1发生显著变化之外，促进精原干细胞自我更新与增殖的重要基因Gdnf  (Meng et al., 2000)也呈现表达增高的趋势。也就是说，从第8天开始，精原干细胞发生大量增殖，那么，第10天Cdh1表达升高，应该与精原干细胞数量增多有关。而第10天与第6天的睾丸组织相比有4 298个基因出现了表达差异。它们分别参与多个生物学过程。所以从Cdh1表达水平上看，似乎这两个时间点没有差异，其实睾丸组织内的众多基因表达水平已发生了剧烈的变化。这些基因的表达水平呈现差异，说明与这些基因相关的生物学过程是呈阶段进展性的。因此，在精原干细胞早期发育过程中，精原干细胞的发生与增殖需要多个生物学过程的配合。基因芯片的结果通过荧光定量PCR得到进一步验证，在我们检测的三个基因中，LOC686076 的功能没有文献报道，也没有参与GO功能分析。TRB3 蛋白(tribbles 3)也叫神经细胞死亡诱导蛋白(NIPK neuronal cell death-inducible protein kinase)，是蛋白激酶B (PKB protein kinase B)抑制剂(Iynedjian, 2005)。也有报道认为TRB3可能通过抑制蛋白激酶A活性来参与代谢综合征(Bi et al.,2008)。CXCL6除了参与炎症免疫反应和信号转导之外，最近发现能够调节多巴胺能神经元的发育，包括神经元的增殖，神经发生以及分化(Edman et al., 2008)，芯片检测显示Cxcl6 基因在第10天与第6天之间转录表达下调36.4倍之多，PCR检测下调达到14.3倍。这一结果暗示Cxcl6基因的表达很可能对精原干细胞的发生与增殖起负面影响。这有待以后的研究工作进一步验证。

通过大鼠精原干细胞早期发育过程中第10天与第6天睾丸组织基因芯片的检测结果，得到大量功能各异的差异表达的基因，尽管这些差异表达基因的功能和作用机制还有待进一步研究，但至少可以得到以下结论：第一，大鼠青春期前睾丸发育过程中第6天至第10天是非常关键的时期；第二，精子发生早期的生物学过程是通过数以千计的基因表达特定的蛋白而起作用的；第三，大鼠精原干细胞早期发育过程，是一个多基因参与的过程。这些结果为我们下一步研究精子发生的分子机制提供了新的思路和信息。

3材料与方法
3.1实验动物与样品　
实验用大鼠(Rattus norvegicus)取三月龄的Wistar-Iamichi雄性大鼠一只，雌性大鼠两只，体重约250 g，合笼, 自然交配。在内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室国家二级清洁型动物房饲养，每周换垫料一次，保证饲料和饮水的清洁和充足。新生大鼠出生当日定为第1天，分别取出生后第6天和第10天的雄性大鼠，颈椎脱位处死后，取睾丸组织样品，提取总RNA。

3.2芯片杂交分析
分别收集大鼠出生后第6天和第10天睾丸组织样品，按照Trizol试剂(Invitrogen)的标准操作抽提总RNA。RNA浓度和纯度分别用Nanodrop ND-1000和甲醛变性凝胶电泳检测，制备cDNA，用NimbleGen One-Color DNA Labeling试剂盒标记cDNA样品，通过NimbleGen杂交系统将cDNA样品与大鼠12×135K芯片探针进行杂交。杂交和清洗之后，用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪进行扫描。本文所有芯片原始数据均上传至GEO公共数据库中，序列号为GSE29666。

3.3实时定量RT-PCR验证
按总RNA提取试剂盒说明，提取大鼠睾丸组织总RNA，根据各样品总RNA的浓度，取相同质量的各组样品按照M-MLV反转录酶说明书进行反转录反应。利用cDNA为模板进行实时定量PCR反应。

我们从基因芯片的结果中选择了3个差异表达的基因，采用SYBR Green Ⅰ荧光染料法进行实时荧光定量PCR扩增，检测它们在出生后第10天与第6天的转录表达水平。每个基因的实时定量PCR检测在Bio-Rad Chromo4^TM 实时PCR检测仪上重复三管。实时定量PCR引物见表4。数据分析通过MJ Opticon Monitor 分析软件(Bio-Rad)完成。计算方法用2^-ΔΔCt法。Gapdh做内参基因，H₂O作阴性对照。所有PCR产物的分子量通过琼脂糖凝胶电泳验证。

表4 实时定量PCR引物序列及参数 Table 4 Primer sequences and real-time PCR parameters

作者贡献
刘陶迪是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成论文初稿的写作；罗奋华参与数据分析；于泊洋参与饲养动物和样品收集；吴应积是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究受教育部“春晖计划”合作科研项目(项目批准号-Z2007-1-01036)和内蒙古自然科学基金项目(项目批准号2009ZD05)资助。基因芯片杂交实验由上海康成生物工程有限公司完成。

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