天然产物一直是药物活性成分的主要来源，统计分析显示从1981年到2010年批准的1 073种新药中近50%来源于天然产物、天然产物的类似物或者衍生物(Cragg and Newman, 2013)。天然产物是可获得的最丰富的化合物多样性来源早已被认可(Koehn and Carter, 2005)，并且代表了最成功的小分子药物发掘策略(Appendino et al., 2010)。天然产物是大自然通过自然选择过程形成的，是大自然经历了无数的高通量筛选过程，除去无活性的同时保留下来的有活性的化合物，这个自然筛选过程通常要比药物学家提供的选择更有效(Appendino et al., 2010; Raskin et al., 2013)，因此天然产物比组合化学提供的化合物拥有更好的药用特性，更容易被人体吸收(Feher et al., 2003)。但是，近年来鉴定的新化合物数量已经有逐渐降低的趋势(Cragg and Newman , 2013)，这一点被描述为“产量危机” (Class, 2002)，于是人类将目光转向地球上生物资源最丰富的资源宝库——海洋。海洋独特的生态环境使海洋微生物在进化过程中产生了化学结构新颖、生物活性特殊的次级代谢产物，因此海洋放线菌吸引了大量的研究兴趣(Lam, 2006; Fenical and Jensen, 2006; Bull and Stach, 2007)。相比于陆地天然产物，海洋天然产物在元素组成上更为独特，由于海水中含有丰富的卤素，所以海洋生物会在代谢过程中生成与卤素原子共价结合的次级代谢产物，这在陆地天然产物中比较少见(Franklin and Butler, 2004; Eustáquio et al., 2008)。此外，海洋天然产物拥有更为优越的化学结构新颖性(Kong et al., 2000)，不仅具有独特的化学骨架结构，而且有的会含有特殊的活性基团，如胍基、异硫氰基等(Reyes et al., 2008; Sorek et al, 2009)。同时，海洋天然产物相比于陆地天然产物也显示出更良好的生物活性，在美国国家癌症研究所对天然产物进行临床药物筛选的实验中发现，受测试的海洋天然产物中1%具有抗肿瘤潜力，而陆地天然产物只有0.1%表现出抗肿瘤活性(Munro et al., 1999)。

本文从筛选新型抗生素角度出发，选取一株从南美洲智利的太平洋沿岸沉积物中分离得到的海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173作为研究目标。德国科学家从这个菌株中分离鉴定了多个具有抗白血病活性的生物碱maremycin A-F (Bindseil et al., 1995; Tang et al., 2001)。我们实验室通过454高通量测序技术测定了该菌株的全基因组序列，通过生物信息学分析，在8.8 Mb的基因组中定位了生物碱maremycins的生物合成基因簇(Zou et al., 2013)，同时发现含有多个聚酮类化合物的基因簇，如色霉素的生物合成基因簇。色霉素属于有良好抗肿瘤活性的金梅酸抗生素家族(Schmitz and Heinemann, 1960)，可抑制多种肿瘤细胞和革兰氏阳性菌的生长和增殖，因而我们开展了色霉素的分离鉴定。首先，我们利用Neighbor-Joining法 (Saitou and Nei, 1987)构建系统发育树确定了该菌株的种属，然后利用HPLC-DAD-MS技术对该菌株进行次级代谢产物的筛选确定色霉素的候选峰，最终从中分离鉴定了色霉素A₃并初步确定了两个新的色霉素类似物。

1结果与讨论

1.1菌株鉴定

根据我们获得的S. sp. B9173的全基因组信息，利用数据库Silva建库进行BLAST比对，确定该菌株的16S rDNA序列，共含有1 801个碱基序列，如图1所示。然后，使用经典的Neighbor-Joining法建立该菌株的系统发育进化树(图2)。BLAST比对结果表明，共有31株已经报道的链霉菌的16S rDNA与B7173菌株的16S rDNA序列具有高度的一致性(>99%)，其中S. rishiriensis的一致性最高，达到99.74%，因此可以初步确定S. sp. B9173属于S. rishiriensis。S. rishiriensis可以产生香豆霉素coumycin A1, 它属于氨基香豆素类抗生素，可结合到原核细胞促旋酶GyrB亚基上来抑制DNA复制(Maxwell and Lawson, 2003)，也可以通过抑制热休克蛋白90来阻止哺乳动物细胞的恶性增殖(Marcu et al., 2000)。

1.2化合物的分离纯化

色霉素的紫外-可见光吸收光谱如图3所示，根据HPLC-DAD分析表明菌株B9173的发酵液中至少含有三个组分具有色霉素的特征紫外-可见光吸收。利用正相硅胶柱色谱→反相硅胶柱色谱→半制备型HPLC (9.4 mm´250 mm, 5 mm, C₁₈)纯化，分离得到了3个具有色霉素特征紫外-可见光吸收的化合物1 (4.4 mg)、2 (0.8 mg)、3 (1.0 mg)。

1.3化合物的结构鉴定

1.3.1色霉素A₃的结构鉴定

化合物1为黄色粉末，微溶于甲醇，可溶于氯仿，易溶于二甲基亚砜。在波长235 nm、280 nm、320 nm和410 nm处有紫外-可见光吸收(图3)。高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出分子加钠峰(m/z)为1 205.507 1，色霉素A₃的分子加钠理论分子离子峰为1 205.498 7 ([C₅₇H₈₂NaO₂₆]⁺)，并且同位素分子离子峰与计算值也非常接近(图4)。为了进一步确认该化合物为色霉素A₃,我们又以氘代氯仿做溶剂，以TMS为内标，对1进行了核磁共振光谱分析，碳-和氢-核磁共振光谱数据如表1所示，与文献报道的核磁共振数据基本一致(Thiem and Meyer, 1979)，因此化合物1鉴定为色霉素A₃。

1.3.2两个色霉素A₃类似物的结构分析

化合物2和化合物3同样为黄色粉末，微溶于甲醇，可溶于氯仿，易溶于二甲基亚砜。在波长235 nm、280 nm、320 nm和410 nm处存在与化合物1相同的紫外-可见光吸收(图3)。它们的高分辨质谱分析给出可能的加氢或加钠的分子离子峰(m/z)分别为1 019.417 3和1 207.432 0 (图5)，通过查阅相关的色霉素类似物的文献(Thiem and Meyer, 1979; Menéndez et al., 2004a; Menéndez et al., 2004b; Hu et al., 2011; Tevyashova et al., 2011; Sabín et al., 2012; Lu et al., 2012; Toume et al., 2014)，发现这样的质谱数据对应的化合物可能是两个未知的色霉素类似物。于是，对这两个化合物进行核磁共振光谱分析，由于分子量大而化合物量少，因此只获得了氢谱(表1)，没有获得碳核磁共振光谱数据，及其他的二维核磁共振光谱数据，故无法确定它们的确切化学结构，只能确认为色霉素类似物，有待进一步分离纯化和鉴定其化学结构。

2讨论

鉴于天然产物在药物研究中的重要作用，以及近年来更多的新化合物从海洋微生物中被分离鉴定出来，因此，本文重点展开了从南美洲智利的太平洋沿岸沉积物分离得到的海洋链霉菌S. sp. B9173的次级代谢产物的分离纯化与鉴定工作。前期，为了研究该菌株产生的哌嗪二酮类生物碱maremycins的生物合成研究，我们利用454测序技术测定了该菌株的全基因组序列。因为该菌株尚未鉴定其种属，因此我们首先提取了该菌株的16S rDNA序列，然后构建了系统发育树，对该菌株进行了种属鉴定，它属于能够产生香豆霉素coumycin A₁的S. rishiriensis的一株。对基因组的生物信息学分析显示，该菌株含有可能是色霉素的生物合成基因簇，但是以往的文献并未报道该菌株能够产生色霉素家族化合物。近年来，大量的放线菌基因组序列已经被测定，并且显示放线菌均含有20~30个不同次级代谢产物的生物合成基因簇，因此我们对该菌株进行色霉素家族次级代谢产物的分离鉴定工作。鉴于以往并没有报道色霉素的产生，可能是由于色霉素的产量极低造成的，因此我们发酵了30 L发酵液，通过萃取富集获得了约12 g粗提物，然后利用HPLC-DAD分析跟踪，通过利用薄层层析、正反相硅胶柱层析、分子筛、液相半制备等技术进行分离纯化，成功分离鉴定了色霉素A₃，并且证实两个类似物的存在。由于该菌株产生另外两个类似物的能力极低，因此无法获得足够量进行完整的核磁共振光谱解析，故无法确定结构，但是从高分辨质谱分析可以确定这两个类似物是以前从未报道过的。我们已经掌握了该菌株的遗传操作系统，并且拥有它的基因组序列，这为我们利用遗传学方法改造该菌株提高这两个新的色霉素类似物的产量，进而获得足够量的化合物进行核磁共振光谱解析，最终确定这两个类似物的化学结构奠定了基础。从该菌株中分离鉴定了色霉素A₃组分，以及确定其他两个类似物的存在对于发现新型的微生物药物有积极的意义，鼓励我们发现更多具有一定生物活性的多样性的次级代谢产物。

3材料与方法

3.1菌株来源和所用培养基

S. sp. B9173为德国HKI研究所馈赠的海洋链霉菌菌株。TSBY液体培养基：葡萄糖103 g，Oxoid tryptone soya broth 30 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。MS培养基：大豆饼粉20 g，甘露醇20 g，蒸馏水1 000 mL。

3.2实验试剂和仪器

甲醇、石油醚、乙酸乙酯等化学试剂购于上海凌峰化学试剂有限公司；HPLC级乙腈产于美国TEDIA试剂公司；氯仿(CDCl₃)产于美国CIL公司；正相硅胶(100~200目和200~300目)购于青岛海洋化工有限公司；C₁₈反相硅胶(50~75 mm)产于YMC公司，购于北京慧德易科技有限公司；凝胶色谱填料Sephadex TM LH-20产于美国GE Scientific公司；冷冻干燥机，LABCONCO公司；核磁共振仪(600 M)，Bruker公司；1260型HPLC，安捷伦(中国)科技有限公司；超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪ACQUITY UPLC & SCIEX SelexION Triple Quad™ 5500 System，美国Waters公司& AB公司。

3.3菌株的培养和发酵

将菌种划线接种于TSB平板，培养箱30℃培养7 d，挑取孢子制成孢子液，用移液器吸取200 μL孢子液接种到装有200 mL TSBY培养基的1 L锥形瓶中，30℃、220 r/min摇床培养36 h，取30 mL种子液接种到装有300 mL MS培养基的2 L锥形瓶中，30℃、220 r/min发酵7 d。

3.4细菌16S rDNA基因序列比对及分析

对已有的S. sp. B9173全基因组信息，采用16S rDNA数据库Silva (http://www.arb-silva.de/)进行BLAST比对和相似度分析，使用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

3.5菌株次级代谢产物的提取

对海洋链霉菌S. sp. B9173进行大量发酵，获得30 L发酵液。将发酵液离心30 min (转速6 000 r/min)，得到上清液和菌体沉淀两部分，合并上清液，菌体进行灭菌处理。上清液用等体积乙酸乙酯剧烈震荡萃取，如此反复3次，将上层有机相于30℃条件下减压蒸馏，蒸去溶剂后获得次级代谢产物粗提物，以备分离纯化。

3.6次级代谢产物的分离及纯化

选用石油醚、乙酸乙酯和甲醇溶剂体系进行薄层层析，根据结果确定正相硅胶色谱柱条件为用200~300目硅胶进行装柱和以100~200目硅胶进行拌样，洗脱条件依次为纯石油醚、石油醚:乙酸乙酯= 2:1、纯乙酸乙酯、乙酸乙酯:甲醇=1:1、纯甲醇，每个梯度体系洗脱3个柱体积。使用三角烧瓶收集组分(50 mL/瓶)，使用安捷伦1260型HPLC配分析柱(5.0 mm´150 mm, 3.6 mm, C₁₈)检测，合并目标化合物组分，HPLC运行条件为0~25 min，乙腈浓度从10%梯度洗脱到100%。然后将目标化合物组分分别过反相硅胶柱与分子筛Sephadex LH-20 (2.0´110 cm; MeOH; 1.5 mL/min)进行分离纯化。最后把得到的目标组分经安捷伦1260型HPLC配半制备柱(9.4´250 mm, 5 mm, C₁₈)进行精制，获得3个单体化合物。

作者贡献

徐向飞负责本论文菌株发酵，化合物分离纯化，数据收集整理及论文撰写；方启负责课题调研、发酵、分离纯化思路的指导；梁祖韬负责系统进化树的构建；林双君教授为通讯作者，负责本论文的选题、课题设计指导、数据分析、文章修改和审定。

致谢

本研究由教育部重大科研项目(NO.311018)和国家自然基金委员会(No.31070057)共同资助。

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