海洋红藻Hypnea musciformis的金属毒性评估和新的代谢产物的鉴定  

D. Isaac Dhinakaran , P. Karthick raja , K. Krishna kumar , G. Vigneshwaran , T. Marimuthu
Department of Biotechnology, Ayyya Nadar Janaki Ammal College, Sivakasi-626124, Tamilnadu, India
作者    通讯作者
海洋生物学学报, 2016 年, 第 5 卷, 第 8 篇   doi: 10.5376/jmb.cn.2016.05.0008
收稿日期: 2016年03月24日    接受日期: 2016年05月12日    发表日期: 2016年05月12日
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Dhinakaran D.I., Karthickraja P., Kumar K.K., Vigneshwaran G., and Marimuthu T., 2016, Identification of Novel metabolites along with the Assessment of Metal Toxicity and Its Implication in Marine Red alga Hypnea musciformis), Haiyang Shengwuxue Xuebao, 5(8): 1-6 (doi:10.5376/jmb.cn.2016.05.0008)

摘要

海洋藻类含有多种生物活性化合物,从海洋藻类生物制药、医疗、化妆品、保健品的商业应用,食品工业和农业。海洋藻类中提取的生物材料商业运用于生物制药、医疗、化妆品、保健品、食品工业和农业。海藻含有大量的营养素,维生素(A,B,C,D和E),矿物质(Ca, P, Na & K),抗氧化剂和膳食纤维,这就是为什么它们被世界各地用作食物,饲料和其他商业用途。因其生化成分,海藻已成为一种重要的食物来源。它们的新化合物也非常丰富,可以探索开发出药物来打击致命疾病如癌症、糖尿病等。本研究采用高效液相色谱法和红外光谱来证明海藻Hypnea musciformis中生物活性化合物的存在,它包括多糖、萜类、烯类、甾醇类等。这些结果表明,海藻H. musciformis可以发展为新生物活性化合物的潜在来源。同样的重金属分析发现其浓度较低,并没有任何影响。通过原子吸收光谱测试法得知这些是(Cd, Fe, Cu, Ca, Cr, Pb, Ni, Co, Mn, Zn)金属。海藻由于其营养价值可以成为膳食的替代品,也可以通过提高质量和扩大海藻产品范围提高商业价值。在未来,这些海洋藻类衍生的材料/化合物将被更多地运用在药物开发的临床前研究上。

关键词
H. musciformis;重金属;生物活性物质;高效液相色谱法

引言 
世界上的海洋,覆盖了地球表面的70%以上,是一个发现潜在治疗药物巨大的资源。在过去的几十年中,许多新化合物及其药物活性已被发现从海洋生物中发现。因此,海洋生物被认为不仅仅是为药物开发提供新生物活性物质一个潜在来源(Burja et al., 2001)。海藻分为绿藻(Chlorophyta)、褐藻(Phaeophyta)、红藻(Rhodophyta)和一些丝状蓝藻(Cyanobacteria)。大多数的海藻是红色的(6000种)和其他已知的是棕色的(2000种)或绿色(1200种)(Kohen and Nyska, 2002)。海藻含有丰富的膳食纤维,矿物脂,蛋白质,ω-3脂肪酸,氨基酸,多糖,维生素A,B,C,和E。对海洋藻类的生物活性研究表明其有许多促进健康的作用,包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌作用(Tabarsa et al., 2012)。使用海洋天然产物能够抑制细菌的发展并提供了丰富的药理潜力。许多报告表明,海藻提供广泛的生物活性,如抗菌、抗病毒、抗炎(Etahiri et al., 2003)。与褐藻和绿藻相反,红藻多为产生卤化代谢产物,特别是溴和碘。到目前为止,许多独特的来源于海洋具有多种生物活性化学化合物已被隔离,它们中的一些被研究调查并被用来开发新的药物化合物(Lima Filho et al., 2002)。

 

病毒的独特结构及其复杂生命周期,已经发现了对抗要求非常苛刻的病毒感染的明确的治疗方法。尽管在近半个世纪都有合适的疫苗和疗法,对病毒感染也有综合研究,但仍有感染,如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV),和登革热病毒(DENV),使近代世界相当比例的人口深受折磨(Lazarus et al., 2014)。海洋世界独特的得天独厚的生活环境让其集有从微生物到巨型海藻各种藻类。从微型硅藻到单细胞生物到达到30米长的海藻等不同类型藻类,都促进了琼脂、肥料、食品、碘源,和钾的重大经济利益(Yasuhara and Lu, 2010)。 然而,生物吸附剂为基础的藻类可以用具有一种用于溶液中的高生物吸附能力的铁炭处理的三氯化铁(FeCl3)进行改性(Roberts et al., 2014)。一个具有潜在丰富的生物吸附应用的生物吸附源用于栽培红海藻提取琼脂的商业垃圾的生产。生长在琼脂培养基上的藻类的属GracilariaGracilaria的商业化种植在世界范围内迅速增长,尤其是在每年生产超过500000吨的印度尼西亚(Sibeni and Calderini, 2012)。许多从海洋藻类中获取的物质如藻酸盐,carrragenean和琼脂phycocolliods已在医药领域使用了几十年。它们表现了抑菌和杀菌活性。像氨基酸、萜类、多酚、甾体类、酚类化合物、卤代酮、烷烃、环多硫化物、脂肪酸和丙烯酸等天然物质在海藻中都能看到(Kidgel et al., 2014)。抗发炎的特性只在两种红藻G. verrucosa 和 G. textorii 中发现。在神经系统疾病中Neorhodomela aculeate的甲醇提取物的抗炎作用包括抑制细胞内活性氧(ROS)生成,H2O2诱导脂质过氧化和诱导型一氧化氮合酶(Lee et al., 2011)。

 

红海的宏藻类适和生活在特定需求的环境中。温度通常是35̊C以上,可用的特定营养物质定义它们的细胞成分。宏观藻类具有高生物活性的化合物,可能被用作抗菌剂来支持人类和动物健康。具有潜在健康或药物和药用活性的新化合物的分离鉴定吸引人们对其进行大量深入的研究(Kajiwaraet al., 2007)。一些研究表明了藻类和植物提取物的抗菌作用,包括藻类Padina tetrostomatica Syringodium isoetifolium ,Haligra  sp.Gelidiella acerosa , Laminaria digitata , L. saccharina , Himanthalia elongate , Palmaria palmate, Chondrus crispus  and  Enteromorpha spirulina ,植被包括抗几种病原菌的Dortenia picta 和Bridelia micrantha (Gupta and Abu,2011)。产生生物活性物质的能力被发现不仅可以作为一种防御机制,从药物的角度来看,还可以作为一个很好的新的生物活性化合物的来源。最近颤藻属中发现了生物活性等位基因化学化合物(Egypitian isolates)。来自淡水的具有多种生物活性的多种独特的化合物已被隔离,它们中的一些被用来开发新的药物(Elsie and Dhanarajan, 2010)。

 

材料与方法
海藻收集
海藻样品采自印度东南海的杜蒂戈林沿海地区。该物种的分类学鉴定为Hypnea musciformis

 

提取物的制备
样品用自来水冲洗去除附生植物和其他海洋生物,再用蒸馏水洗净。样品在阴凉处晾干并磨成粉末,用溶剂甲醇制备提取物。

 

红外光谱分析
对海洋藻类提取物样品进行红外光谱分析。所有的红外光谱在中红外波段(40000-400 cm 1)室温(26°C或1°C)下使用傅里叶变换红外光谱计FT-IR – spectrum RX I记录(PerkinElmer, USA)。通常情况下,20次扫描信号平均为一个单一的频谱。在用超红外软件计算反射吸收光谱时,每个光谱都按吸收率显示。

 

高效液相色谱分析
用高效液相色谱法对各样品的提取物进行了定量制备。从每个原生提取物中抽出1.5毫升进行高效液相色谱定量分析,200µl被转移到一个小玻璃瓶中并高速真空浓缩进行溶剂去除。得到的残余物被溶解于500µL乙腈:水1:1 +0.5%三氟乙酸,10µL自动注射取样于HPLC。

 

重金属测定
海洋红藻Hypnea musciformis 提取物接着被倒入自动分析仪的杯子,重金属浓度(Cd、Fe、Cu、Cr、Pb、Ni、Ca、Co、Mn、Zn)用原子吸收分光光度法(AAS)测定。提取物中重金属的浓度值是基于PPM计算。

 

结果
海洋红藻标本从Tuticorin海岸收集(图1)。分析了藻类的分类地位。图2说明了使用傅里叶变换红外光谱计分析检测Hypnea Musciformis  的海洋生物活性化合物,发现了一类丰富的多糖硫酸化岩藻糖岩藻聚糖硫酸酯,接着也观察到了类胡萝卜素和岩藻黄质三萜苷。用高效液相色谱法分析Hypnea musciformis 的甲醇提取物,并对合成的天然化合物进行检测。图1显示了海藻Hypnea musciformis里的海洋衍生天然产物像β-类胡萝卜素和维生素E的检测。海藻衍生的植物固醇可分为四组进行检测,分别为4-desmethyl-Δ5-sterols, 4-desmetyl-Δ7-sterols, 4-methyl sterols 和 dihydroxylated sterols。HPLC分析表明,最丰富的酚类化合物是表儿茶酸(如没食子酸、对羟基苯甲酸、儿茶素、表儿茶素没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸、邻苯二酚)。图3表1显示了在藻类中的存在重金属(Cd, Fe, Cu, Ca, Cr, Pb, Ni, Co, Mn, Zn)。

 

  

图 1 藻类Hypnea musciformis

 

   

表 1 海洋红藻 Hypnea musciformis的重金属浓度

 

讨论
天然产品在发现过程中发挥了重要的作用。因此,寻找新的藻类天然化合物应该用在有前景的药物研究领域。从海藻中提取的生物活性化合物的许多报告已经公布,并确认它们产生具有高度复杂和显着不同的药理和生物特性的代谢产物的能力。海藻作为药用是次生代谢产物,包括生物碱、苷类、黄酮类、皂苷、鞣质、类固醇激素。相关的活性代谢产物具有重要的药用价值,已被广泛应用于医药、医药等行业。海藻Ulva fasciata, Caulerpa scalpelliformis, Halimeda macroloba, Enteromorpha compressa, Caulerpa corynephora 和 Ulva lactuca 揭示了大量的次生代谢产物的存在(De Almeida et al., 2011)。

 

  

图 2 海洋红藻Hypnea musciformis的FTIR研究

 

在本研究中的红藻含有次生代谢产物如烯烃、甾醇类、萜类等。海洋藻类一直被用作食品和药品。这是因为它们含有必需的氨基酸和多不饱和脂肪酸,必需的维生素和矿物质,以及大量的膳食纤维。其他报告表明,海藻多糖和蛋白质类物质具有免疫调节的价值功能并且能够降低血压、胆固醇和血糖水平(Thomas and Kim, 2011)。海藻是海洋生物中提供了迄今为止最高的化合物的。具有生物活性的红藻类代谢产物中,从Canary岛的Laurencia viridis中分离的三萜类聚醚dehydrothyrsiferol具有良好的细胞毒性活性。因此,它对人雌激素受体乳腺癌细胞株的细胞毒性效应在临床前药理学评价上被研究 [ 17 ]。三种不同的岩藻聚糖硫酸酯被从褐藻Sargassum mcclurei中分离和纯化。岩藻聚糖硫酸酯SMF1和SMF2是硫酸化多糖,包括岩藻糖、半乳糖、甘露糖、木糖和葡萄糖,SmF3岩藻聚糖硫酸酯是高度硫酸化(35%)galactofucan。所有岩藻聚糖硫酸酯分裂细胞毒性较低,显示在结肠癌DLD-1细胞集落形成的抑制作用(Kim et al., 2010)。波斯湾海藻Gracilaria corticatafrom的水提取物显示在Jurkat和蜕皮4人淋巴细胞白血病细胞株抗肿瘤活性上(Yanti et al., 2015)。褐藻门或褐藻显示明显的抗肿瘤活性,作为潜在的化疗或化学预防剂,褐藻多糖硫酸酯与类胡萝卜素是褐藻最重要的活性代谢产物(Cornish and Garbary, 2010)。绿藻Bryopsis sp. 为对HL-60细胞系抑制的环状缩肽kahalalides P和Q kahalalides的抑制源。环状缩肽kahalalide F最初是从软体动物 Elysia rufescenes和膳食来源绿藻Bryopsis sp.中隔离。作为一种抗前列腺癌的铅化合物被制药公司Mar引入I期临床试验。(Chen et al., 2013)。在红藻Hypnea musciformis中发现钙的最高水平,看到镍和钴的痕迹,锰和锌的含量也很高。

 

  

图 3 Hypnea musciformis的HPLC分析

 

致谢
作者们衷心感谢Ayya Nadar Janaki动物学院的校长和领导对他们的支持和鼓励。

利益冲突:没有利益冲突。 

 

References 

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