植物细胞悬浮培养(Cell suspension culture)是指在液体培养基中的植物单细胞或小的单层细胞聚集体，在摇床上，以一定的转速和培养温度，进行培养的一种生物技术方法(吴春霞, 2009)。与常规栽培植株生长比较，植物悬浮细胞培养方法具有较多优势：来源一致、生长条件可控制、细胞生长均匀、用于研究的试材用量相对较少而且用于机理研究的各种反应更为迅速且一致等(王满和李霞, 2009)，它也可用于细胞全基因组杂交、获得植物原生质体、基因导入、次生代谢产物的生产、快速诱变出突变体，培育人工种子以及保护濒危木本植物等方面(陈志等, 2007; 袁金玲等, 2009)，可见，植物悬浮细胞技术体系在现代植物生物学的各个领域等都有广泛应用(王满, 2011; 方文娟等, 2005)。

Maurice等将玉米C₄光合途径中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenlpyruvate carboxylase, PEPC)的全基因(pepc)，采用农杆菌介导的方法，导入水稻粳稻品种Kitaake，实现了基因的高表达，并且籽粒产量表现提高了10%~40% (Ku et al., 1999)，从而掀起了利用C₄光合特性改造C₃植物，以增强光合效率和提高水稻产量的热潮(李霞和焦德茂, 2005)。而伴随高表达玉米C₄型光合酶基因pepc水稻的稳定选育，不少的研究结果表明：高表达玉米C₄ pepc水稻具有高光效、抗旱以及耐光氧化胁迫等特性(李霞等, 2005a; Bandyopadhyay et al., 2007; 张边江等, 2008; 周宝元等, 2011)。但这里引发的问题是如何导入一个C₄光合途径关键酶的基因则引起水稻多种生理特性的改变？已有研究表明；该基因的高表达也引起了第二信使分子如磷脂酸(Li et al., 2011)、H₂O₂ (任承刚和李霞, 2010; 李霞和任承钢, 2012)和NO (陈平波和李霞, 2012)的变化，暗示该基因的表达可能诱发了体内信号传导途径的变化，但这些研究均在整体植株水平上的。在细胞学水平乃至单细胞水平的深入研究，则更有利于该材料高光效特性分子机理的揭示，因此，该材料悬浮细胞的建立是在细胞和分子水平上研究其机理的前提和基础。

本研究以高表达玉米C₄型pepc基因水稻(PC)和未转基因的野生型Kitaake (WT)为研究材料，从种子活力、外源激素的添加、渗透调节物质的调节以及培养温度等因素上，研究供试水稻悬浮细胞系的方法，试图进一步优化供试水稻悬浮培养条件，从而建立高效稳定的水稻成熟胚悬浮培养体系，该研究将为高表达玉米C₄ pepc水稻的分子机理的深入和遗传改良提供技术支撑。

1结果分析
1.1供试水稻种子发芽率影响其愈伤组织的诱导
两个供试材料PC和WT种子在M8基本培养基上7 d的发芽率均高达95%，外施激素6-BA，它的浓度从0、0.5 mg/L、1 mg/L以及1.5 mg/L增加，对供试水稻发芽率影响不大(表1)。其中WT种子的发芽率则高于PC的，并且可以观察到，接种培养14 d后，WT出愈率则始终高于PC的，而且适当加入低浓度的6-BA (0.5 mg/L)，则可显著增加其出愈率，但随6-BA浓度的增加，则其出愈率则下降。可见，较强的水稻种子活力可能有利于水稻愈伤组织的早发。
 

 
已有研究表明，外源激素ABA添加对水稻等禾谷类作物胚性愈伤组织的诱导，胚状体的发生以及在继代培养中诱导出更多胚性愈伤组织等均起重要作用(李霞等, 2005b)。从表2看，加入ABA后，对2个供试材料的发芽率没有影响，但是将6-BA和ABA联合施用，则可部分增加2个供试水稻7 d后的出愈率，可见ABA单独添加对水稻的出愈作用有限，但当它和6-BA联合添加，则均可显著提高水稻的出愈率。
 

 
1.2不同浓度2,4-D对供试水稻愈伤组织的诱导
表3表明了不同浓度2,4-D对供试水稻愈伤组织诱导的作用。对WT而言，以N6为基本培养基，再单独添加了不同浓度的2,4-D，培养7 d后，其中添加3 mg/L或者4 mg/L 2,4-D才能诱导出供试材料的愈伤组织，其出愈率分别只有13%和10%，表明，在水稻成熟胚愈伤组织诱导的培养基中添加较高浓度的2,4-D，对其愈伤组织诱导的尽早启动有一定促进效果。而对本研究的供试材料而言，3 mg/L 2,4-D为适宜浓度，低于或高于这个浓度范围，则无此效应；但随着诱导时间的延长，当接种21 d后，在添加不同浓度2,4-D的5种培养基上，均诱导出了愈伤组织，而且随2,4-D浓度的增加，出愈率有增加的趋势，其中添加5 mg/L 2,4-D的培养基中水稻成熟胚的出愈率最高，其中WT的为40.40%。但与WT相比，PC的出愈率相对很低。表4也进一步显示，ABA和2,4-D联合施用，也有利于WT愈伤组织的较早启动和高频发生，而PC则在3 mg/L 2,4-D，1 mg/L 6-BA和1 mg/L ABA三种激素联合施用的培养基上，略微提高其出愈率。可见，在水稻成熟胚愈伤组织诱导中，不同的基因型对激素的反应是不同的，在2,4-D脱分化的基础上，适当添加ABA或者6-BA和ABA联合使用，有利于提高水稻成熟胚的愈伤组织的诱导率。

1.3有机附加物对供试水稻诱导愈伤组织的影响
不少研究显示，附加有机成分能够提高愈伤组织的出愈率(李霞等, 2008; 胡燕梅等, 2010)。表5结果表明，PC在添加2 mg/L 2,4-D和1 mg/L ABA的愈伤组织诱导培养基中，再继续添加2.8 g/L脯氨酸和0.3 g/L水解酪蛋白，接种21 d后，出愈率高达84.30%，显著提高了其出愈率；而加入2.8 g/L脯氨酸和0.3 g/L酸解酪蛋白的培养基中，其愈伤组织的出愈率也为60.20%；而添加上述有机成分也对WT的出愈率有明显提高效果，与PC不同的是，它对于添加酪蛋白的类型差别不大，分别在加入2.8 g/L脯氨酸和0.3 g/L酸解酪蛋白以及2.8g/L脯氨酸和0.3g/L水解酪蛋白的培养基上，其愈伤组织出愈率分别为81.20%和79.20%，可见添加有机成分不仅可提早启动水稻成熟胚愈伤组织的诱导，而且显著提高了其出愈率，但是不同类型的酪蛋白对不同基因型作用有差异。
 

1.4培养温度对供试水稻诱导愈伤组织的影响
表6则表明了在不同温度培养下，供试水稻种子的愈伤组织诱导率的变化。在相同组分的水稻成熟胚愈伤组织诱导培养基上，接入供试水稻的种子，分别放置在(22±2)℃、(28±1)℃和(30±1)℃等3个温度下培养，21 d后，其中在(28±1)℃培养的供试水稻的诱导率为3种温度设置培养中最高的，WT的种子可全部诱导出愈伤组织，而PC的也高达92.30%；(30±1)℃的较低，(22±2)℃的最低。而在同一诱导温度下，WT的出愈率始终比PC的高，可见，水稻的基因型对其出愈率的影响仍明显。而种子诱导的最适温度可明显促进供试水稻成熟胚愈伤组织的诱导。但是本文报告的最适培养温度和吕孟雨等报道的有所不同(吕孟雨等, 2005)，分析可能是水稻基因型的不同所致。
 

1.5不同琼脂浓度对供试水稻愈伤组织形态的影响
为了诱导出适合悬浮培养的米粒状愈伤组织，进一步将在表5中最适培养基组分的培养基上，附加不同浓度的琼脂浓度，观察其诱导的愈伤组织的形态。表7表明，在7 g/L琼脂浓度的诱导培养基上，PC的愈伤组织生长最快，且诱导出均是适合悬浮培养的米粒状愈伤组织。8 g/L的琼脂浓度则生长速度则慢于7 g/L的琼脂浓度的，愈伤的组织形态与7 g/L的琼脂浓度的类似，而琼脂浓度为9 g/L的培养基上，不仅愈伤组织生长缓慢，而且诱导的愈伤组织多为湿润且大块的，不适合悬浮培养的继续培养的细胞状态,可见，从生长速度和形态上分析，7 g/L的琼脂浓度最有利于快速诱导出米粒状的愈伤组织(图1)。
 

 
1.6继代培养对供试水稻愈伤组织生长和形态状态的调节
对于高频水稻悬浮培养体系而言，不仅要求其愈伤组织更分散，更疏松，而且要求愈伤组织有快速的生长能力，因此，水稻成熟胚诱导愈伤组织的继代能力是建立高频和稳定的水稻悬浮培养技术体系的前提和基础。尤其与以水稻幼胚和幼穗为外植体所诱导的愈伤组织比较，成熟胚诱导的更容易褐化，继代培养更困难(方文娟等, 2005)。从表8看出，将WT种子接种于M2的培养基中诱导,其愈伤组织转入继代培养基M1 (降低了2,4-D, 增加了6-BA),可降低褐化率，2次继代于M16的培养基中(再次降低了2,4-D和6-BA浓度)，则可培养出数量较多且为米粒状的愈伤组织。将WT种子接种于M3的培养基中诱导，愈伤组织转入继代培养基M4 (也降低了2,4-D和6-BA的浓度)，同样可显著降低褐化率，继续降低2,4-D和6-BA的浓度,可培养出较多米粒状愈伤组织。PC的继代过程采用类似的方法也可获得较多米粒状愈伤组织，可见，渐次降低2,4-D浓度，适当增减6-BA的浓度，有利于诱导长出适合水稻悬浮培养的米粒状愈伤组织。
 

 
1.7供试水稻悬浮细胞系的生长曲线
将米粒状且生长均匀的水稻悬浮细胞继代于不同2,4-D浓度，溶氧量和新原液比例的培养基中培养，然后测定水稻悬浮细胞的生物量。结果表明：在含有2 mg/L 2,4-D的激素下，供试水稻悬浮细胞生物量增殖的最快，表现为其净鲜重和净干重都最大(表9)。表10显示2:1、3:1和4:1等不同浓度的新原液比例均对悬浮细胞生长有轻微影响，其中新原液比例为3:1时，干重累积最高，2:1时次之，4:1时最低。表11则表明100 mL三角瓶中接种20 mL的培养液，其中的悬浮细胞生长最快，干重累积最大，两供试材料PC和WT的表现均类似。
 

1.8供试水稻悬浮细胞生长曲线的测定
根据本研究适宜的悬浮培养的培养条件，按3:1新原液量比例，将20 mL培养液接种到100 mL的三角瓶中，在28℃下培养，用于测量悬浮细胞的生长曲线，每隔2 d测量一次悬浮细胞的鲜重和干重，共测定了14 d。图2显示了供试水稻悬浮细胞在14 d内的细胞培养物鲜重(图2A)和干重(图2B)生长变化，2个供试材料的悬浮细胞干物质累积均呈单峰曲线，接种开始至第4 d时，物质累积最快，是悬浮细胞的旺盛生长期，第4 d达到峰值，之后干重逐渐下降，生长缓慢，可见，该水稻悬浮细胞的生长周期为7 d，而PC和WT的生长曲线表现类似。
 

 
2讨论
2.1水稻成熟胚诱导愈伤组织技术的建立是水稻稳定高效悬浮细胞系建立前提
基因型的差异是水稻成熟胚愈伤组织培养力差异的内在因素(阎丽娜等, 2010)。本研究表明，在不同的培养基、琼脂和激素的调节下，WT的出愈率始终要高于PC的，这与其种子的发芽率有一定相关。PC的活力比WT的低，而且其成熟胚的出愈率也低，可见，基因型的选择是其组织培养力的发挥的重要因素，而选择新收获的发芽率较高水稻种子也有利于愈伤组织的高频诱导。

培养温度是诱导植物愈伤组织关注的重要环境条件，不同水稻材料成熟胚愈伤诱导所需的适宜温度有差异，过高或者过低温度均适合其愈伤组织的诱导和快速增加(吕孟雨等, 2005)。本研究表明：当培养温度低于25℃时，水稻愈伤组织诱导率极低且愈伤组织生长缓慢，而大于32℃时，虽诱导率有所提高，但是愈伤组织也加快生长，但是愈伤组织多呈水渍、絮状和大颗粒，容易褐化，不利于继代。只有28℃左右培养时，其不但愈伤组织的诱导率最高，而且愈伤组织生物量增长也最快，尤其是其愈伤组织的形态呈小颗粒状，分散且疏松，多次继代，愈伤组织不褐化，其继代能力最强。所以，本研究中适合供试水稻高频诱导愈伤组织且易于诱导出米粒状、疏松和分散形态的愈伤组织的最适培养温度在28℃左右，可见，28℃为水稻成熟胚来源诱导的愈伤组织建立水稻悬浮培养技术的适宜温度。

不少研究表明，在水稻成熟胚愈伤组织诱导的培养基中添加一些小分子有机营养物质如氨基酸类，可显著提高其愈伤组织的诱导率以及增加其生物量累积(胡燕梅等, 2010; 李霞等, 2005b)。在本研究中，在采用N6基本培养基为主要成分的愈伤组织诱导中，附加一定浓度的激素组合，进一步添加2.8 mg/L脯氨酸和0.3 mg/L水解酪蛋白等有机营养物质，对供试水稻愈伤组织诱导率的提高以及愈伤组织形态的调控有明显的促进作用，WT和PC的均可提高2~3倍的愈伤组织诱导率。

2.2渐次降低继代培养的外源激素浓度是培养分散和颗粒状水稻愈伤组织的关键
外源激素是调节水稻愈伤组织形态的重要手段，但是不同水稻材料需要的激素水平不同。本研究表明：虽然2个供试材料成熟胚愈伤组织诱导的最适培养基成分不同，但在继代培养中，2个供试水稻材料均在原有愈伤组织诱导培养基组分的基础上，均逐渐降低2,4-D和6-BA浓度，均可诱导出米粒状、疏松且生长迅速的愈伤组织，最终有利于快速培养出生长旺盛且均匀的细胞团和单细胞层，建立高效稳定的水稻悬浮细胞培养体系。而将2材料的疏松的米粒状愈伤组织转移到液体培养基中的生长，2材料对激素、新原液比以及溶氧量等则差异不大，均在42 d即可诱导出分散和米粒状的水稻悬浮细胞系。2材料悬浮细胞系的生长特征也差异不大，生长周期均为7 d，接种至第4 d，悬浮细胞生物量增加最快，不论是鲜重还是干重增加明显，其生长最旺盛，到培养的第4 d时，生物量达到最大值，而到第6 d生物量累积缓慢，干重增加放缓(王满, 2011)。因此，在继代培养基中，通过外源激素的降低逐渐调节水稻愈伤组织的激素水平，均诱导出的米粒状且分散的愈伤组织，这是水稻悬浮细胞培养技术的关键和难点。本研究建立了供试水稻材料的悬浮细胞培养技术，该技术水稻悬浮细胞培养7 d为一个生长周期，第3~4 d，物质累积最大。该技术的建立，可用于深入研究转C₄ pepc基因水稻高光效的分子机理。

3实验材料与方法
3.1实验材料
实验使用的水稻材料为高表达玉米C₄型光合酶基因pepc水稻(PC)和未转基因的野生型Kitaake (WT)，分别保存在江苏省农业科学院内(李霞等, 2001)。

3.2培养基的配置
3.2.1水稻愈伤组织诱导的培养基
本研究采用的基本培养基为M8和N6，按其大量元素、微量元素及其有机成分的比例配制，其中M8参照梅传生等方法(梅传生等, 1988)，琼脂浓度为8 g/L，蔗糖浓度为30 g/L；设置附加0~5 mg/L的2,4-D；0~1 mg/L脱落酸(absciss acid, ABA)；0~3 mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)，pH 5.8，在120℃下高压灭菌20 min。

3.2.2水稻愈伤组织继代的培养基
水稻愈伤组织继代培养基是参照N6的基本成分配制，蔗糖浓度为30 g/L，添加不同浓度的2,4-D、A-BA、6-BA和细胞分裂素(KT)等，琼脂浓度配置3个浓度，分别为7 g/L、8 g/L和9 g/L，pH为5.8，在120℃下高压灭菌20 min。

3.2.3水稻悬浮培养的液体培养基
基本培养采用N6的大量、微量元素及有机成分配置，并添加的蔗糖浓度为30 g/L，琼脂为8 g/L，脯氨酸为2.8 g/L，水解酪蛋白为0.3 g/L，2,4-D浓度为2 mg/L，pH 5.8，在120℃高压灭菌20 min。

3.2.4供试水稻成熟胚愈伤组织的诱导
参照李霞等(2005b)方法，将供试水稻成熟种子去种壳，经75%乙醇浸泡，表面消毒5 min，弃去该消毒液，再用0.1%升汞溶液浸泡15 min，再弃该消毒液，最后用无菌水冲洗4次，放入(28±2)℃培养室过夜，次日再用70%乙醇浸泡，以进行第二次表面消毒，5 min后弃该消毒液，之后用0.1%升汞溶液浸泡，5 min后弃该消毒液，最后用无菌水冲洗4次。将消毒的稻种分别接种到不同的诱导培养基中，以上操作均在无菌的超净工作台进行，然后，接种好的培养基分别放在不同的培养温度下，暗培养30 d．统计愈伤数，计算诱导率。

3.2.5供试水稻成熟胚愈伤组织的继代培养
将上述供试水稻材料成熟胚诱导的愈伤组织，转移到继代培养基上，继代培养基的成分见表12，在(28±2)℃暗培养，隔7 ds继代1次，记录供试水稻材料愈伤组织的生长情况。
 

 
3.2.6供试水稻悬浮细胞培养系的建立
按照王满(2011)的方法，挑选继代培养中米粒状、疏松且分散的愈伤组织块约3 g，转接到100 mL容积为250 mL的三角瓶的液体培养基中，放在恒温摇床上，进行培养，培养温度为(28±2)℃，摇床转速(110±10) rpm。培养第7 d后，进行第一次液体培养基的继代培养，除去较大颗粒的细胞团，保留1/3的培养原液以及1 mm直径的愈伤组织颗粒，再补充新鲜培养液到100 mL，以相同的培养温度和转速培养，每7 d转接新鲜的培养基，继代培养1次。当继代6次以后，就可建立高频和稳定的水稻悬浮细胞技术体系。

3.2.7水稻悬浮细胞生长曲线的测定
将得到均一水稻悬浮细胞，称取等质量的水稻悬浮细胞培养物，分别转接于含有不同2,4的培养基，分别称量不同时间培养的水稻悬浮细胞鲜重。并将等质量的水稻悬浮细胞，移入同样体积的三角瓶中，培养液总体积为10 mL、20 mL和30 mL，初步确定供试水稻悬浮细胞生长的最适溶氧量。在水稻悬浮细胞液总体积相同的条件下，再加入不同比例的新原液比例，确定供试水稻悬浮细胞生长的最适新原液比例。供试水稻悬浮细胞的鲜重，则均通过低温离心，搜集不同培养时间的水稻悬浮细胞培养物，然后测量其鲜重，然后再放入鼓风干燥箱内，在120℃杀青20 min后，在80℃烘干为恒重，再称其干重，确定适宜的新原液比例，最后在适宜的培养条件下，绘制供试水稻材料培养细胞的生长曲线。

作者贡献
王满和石牡丹是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王满及钱宝云完成数据分析，论文初稿的写作；魏晓东和方先文参与实验设计，试验结果分析；李霞是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(30871459)和江苏省自主创新课题[CX(11)1020]共同资助。

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