福建省茶树栽培历史悠久，是我国茶树无性系品种的起源地。闽南地区作为福建乌龙茶的主要产地，拥有较为丰富的茶树种质资源，广大茶农和育种工作者在长期的生产实践和育种研究中，采用单株选育和杂交育种等方法筛选、培育除了铁观音、黄金桂、梅占、毛蟹、本山、八仙等一批通过国家审(认)定的茶树良种，是福建乌龙茶茶树品种资源较为丰富的地区。因此，对这些茶树遗传多样性的研究和评价有利于提高这些茶树资源在茶树优质、高产和特异性育种领域的应用。

福建省茶树栽培历史悠久，是我国茶树无性系品种的起源地。闽南地区作为福建乌龙茶的主要产地，拥有较为丰富的茶树种质资源，广大茶农和育种工作者在长期的生产实践和育种研究中，采用单株选育和杂交育种等方法筛选、培育除了铁观音、黄金桂、梅占、毛蟹、本山、八仙等一批通过国家审(认)定的茶树良种，是福建乌龙茶茶树品种资源较为丰富的地区。因此，对这些茶树遗传多样性的研究和评价有利于提高这些茶树资源在茶树优质、高产和特异性育种领域的应用。

对茶树种质的遗传特性进行有效的鉴定和评价，有利于提高茶树种质资源研究与利用的水平。分子标记技术可用于研究了解茶树基因遗传变异情况、茶树居群分布及其进化关系，可增加茶树育种的针对性，提高育种效率。在茶树种质遗传多样性和种质亲缘关系研究方面，DNA分子标记技术有着广泛的应用，并以其扩增多态性丰富、准确性高、重复性好、不受器官发育时期的特异性以及环境影响且易于分析等特点，在种质鉴定和遗传基础分析等研究领域具有较大潜力(王建波, 2002)。RAPD分子标记基于PCR技术基础，可应用于构建物种的DNA指纹图谱并利用其进行种质鉴定、分析评价物种亲缘关系的远近以及物种进化演进等研究(李娟等, 2005)。目前，RAPD技术已用于甘薯(王红意等, 2009)、小麦(程保山等, 2011)、黄瓜(刘丽娟等, 2009)、黄芪(高霞等, 2011)、百合(童巧珍等, 2010)等植物的基因指纹图谱和种质亲缘关系鉴定等研究，在茶树系统进化和演变、茶树亲缘关系鉴定评价等方面，RAPD技术也以其扩增多态性好，扩增效果稳定，可直接反映茶树在基因水平上的变化和差异等特点，广泛应用于茶树遗传多样性及亲缘关系(林政和等, 2006; 黎星辉等, 2007; 李娟等, 2005; 王雪萍等, 2007)、特异性茶树种质筛选鉴定(王会等, 2008; 李开荣等, 2007, 浙江农业科学, (1): 50-55)等研究领域。

本研究基于RAPD分子标记技术构建了30份福建闽南乌龙茶茶树种质的DNA指纹图谱，研究了供试种质的遗传多样性，揭示了30份茶树种质的遗传亲缘关系，为有效鉴定和分析乌龙茶茶树种质资源遗传性状，筛选适宜的亲本进行育种研究提供科学依据，也为保护部分优异乌龙茶茶树种质资源的知识产权提供理论参考。

1结果分析
1.1RAPD引物扩增多态性分析
筛选出的10条扩增多态性较好、条带清晰的引物在30份茶树种质中共扩增出103条谱带，其中80条为多态性谱带，多态性比率达到77.67%。从表1中可以看出，不同引物扩增储的多态性条带在6~13条之间，平均每条引物扩增出8条多态性条带，这说明供试茶树种质具有较为丰富的遗传多样性。使用不同引物扩增获得的条带数量在9~15条之间，平均每个引物扩增出11.36条；其中引物S183扩增出13个位点的条带，扩增条代数最多(图1)。由此可可知，采用RAPD分子标记方法用于乌龙茶茶树种质资源指纹图谱的构进而区分不同茶树种质是可行的。
 

 
1.2闽南龙茶茶树种质指纹图谱
应用分子标记技术鉴别种质，使用尽可能少的扩增引物数量获得最高效的鉴别效果尤为重要(刘本英等, 2008)。本实验筛选出的10条引物中，S118、S294、S183、S467、S481等引物均产生了丰富的谱带类型(表2)，在鉴别试验供试样品中表现出高效性，如利用引物S118和S294所产生的特异型谱带，均可独立鉴别出30份乌龙茶茶树种质中的24份种质，利用引物S183的特异型谱带则可鉴别出17份种质。
 

 
同时，应用不同引物组合也能有效鉴别出供试茶树种质，如将引物S118和S294结合可以鉴别出供试样品中的29份茶树种质，再增加S467、S113、S154、S183和S481中任意一条引物即可鉴别出所有30份茶树种质。由此表明，使用RAPD分子标记技术构建茶树DNA指纹图谱，鉴别乌龙茶茶树种质资源是可行的。

1.3闽南乌龙茶茶树种质遗传距离及聚类分析
利用筛选出的10条扩增多态性较好、条带清晰的引物的RAPD扩增数据计算30份闽台乌龙茶茶树种质资源的遗传变异系数，其JACCARD相似系数介于0.476~0.836之间，平均相似系数为0.603，其中金观音和白芽观音遗传相似度最高，相似系数达0.836，金面观音和佛手遗传距离最远，相似系数为0.461。

采用UPGMA法，分析RAPD扩增谱带统计计算的原始矩阵，构建了30份闽南乌龙茶茶树种质的遗传关系聚类图(图2)。30份茶树种质可分为两大类群，类群1只有筲绮和大叶乌龙两个品种，说明他们与其他种质间的亲缘关系较远。类群2可分为3亚类，其中水仙、金面观音和赤叶聚为第一亚类，铁观音、佛手、杏仁茶、雪梨、科山种聚为第二亚类，其余种质聚为第三亚类，与第一、第二亚类亲缘关系较远。第三亚类中包含三个亚群，乞丐仙、红骨乌龙、红芽观音和梅占聚为亚群一，白芽观音、金观音、毛蟹、本山、祥华8号、安溪肉桂聚为亚群二，亚群三包括2个小亚群，台茶12号、祥华1号、安溪白茶、桃仁聚为一小亚群，圆叶黄棪、皱面吉、黄金桂、八仙、凤圆春、白观音聚为另一小亚群。
 

 
2讨论
2.1闽南乌龙茶茶树种质资源遗传多样性
依据Wachira等(1995)应用RAPD技术研究了肯尼亚38份无性系茶树种质资源，得出其扩增多态性为62%，本实验的供试样本多为闽南地区特别是安溪地区的茶树品种(系)，运用RAPD分子标记技术依然表现出较高的遗传多态性(77.67%)，说明运用RAPD分子标记技术分析乌龙茶茶树种质资源遗传多态性是可行的，也表明安溪地方茶树种质遗传多样性水平较高。

2.2闽南乌龙茶茶树种质资源遗传亲缘关系
依据姚明哲等(2007)的研究，我国无性系茶树栽培品种的相似系数在0.58~0.84之间，Mirshra和SenMandi (2004)研究了29份印度大吉岭地区的无性系茶树种质，得出其相似系数为0.68~0.92，表明这些茶树种质遗传基础都比较狭窄。本实验30份乌龙茶茶树种质多为无性系，从其Jaccard遗传相似性分析结果看，遗传相似系数多在0.6以上，也表明它们的亲缘关系较近，较高的遗传相似系数也可能与供试茶树样本多原产于安溪地区有关，所以，在后续的茶树育种研究中，可适当扩大育种亲本的选择范围，适当选择具有遗传特异性的优良茶树种质及野生茶树种质资源。

2.3乌龙茶茶树种质资源遗传特性鉴定
茶树为高度杂合体，且为异花授粉植物，在长期的压条、扦插和杂交育种等繁殖进程，产生并积累了大量的不连续变异，在无严格生殖隔离的情形下，其遗传背景趋于复杂，同时，异地种植的茶树其遗传特性长期受当地生长环境和立地条件的影响也可能发生变化(刘本英等, 2008; 陈文雄等, 2008)。本实验所取的30份样本特别是其中一些皆发源于统一地区的茶树种质，在遗传聚类分析时也被划分为明显不同的类群，这也可能是由于杂交所引起不连续变异以及长期压条、扦插等无形繁殖方式带来的变异累积导致的。

闽南乌龙茶茶树种质资源分子指纹图谱和遗传多样性的研究有利于乌龙茶茶树种质资源的分子基因水平研究的深入开展，对乌龙茶茶树遗传育种和种质改良、优质特异茶树种质保护、乌龙茶核心种质的构建也在种质遗传水平提供了更为充分的科学依据。

3材料与方法
3.1实验材料
供试材料为30份闽台茶树种质(表3)，采自福建安溪县茶叶科学研究所种质资源圃。实验剪取无病虫害、健康完整的一芽一叶或一芽二叶，用液氮速冻固样30 s后，将样品至于-80℃的超低温冰箱中储藏备用。
 

 
3.2茶树DNA提取技术
使用改良CTAB-mini法提取茶树DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，使用紫外分光光度计检测260 nm和280 nm的OD值并计算DNA纯度和浓度。

3.3 RAPD引物筛选
从37对RAPD引物中筛选出11条扩增多态性好、条带清晰的引物，用于本实验供试材料DNA的RAPD-PCR扩增。所有引物均由上海Sangon生物工程技术服务有限公司生产合成。

3.4 RAPD扩增体系
使用BIOMETRA Tprofessional Standard 96 PCR仪进行RAPD的扩增反应，PCR的扩增反应体系采用20 μL体系，即：2.0 μL (20 ng/μL)的DNA模板，2.0 μL 10×PCR Buffer，1.6 μL dNTP (2.5 mmol/L)，0.3 μL 的Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，0.7 μL的随机引物(10 mmol/L)，13.4 μL的ddH₂O补足反应体系。

PCR的扩增反应程序如下：首先94℃预变性4 min，后94℃变性45 s，38℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，进行40个反应循环，最后72℃延伸10 min，在4℃保存。

扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中进行电泳，电场为5 V/cm，电泳后用EB染色，用UVP GelDoc-It凝胶成像系统拍照记录。

3.5数据处理与分析
对凝胶电泳成像图进行人工读带，将成像图上可重复的、清晰的扩增条带计为“1”，同一扩增位点处无条带或肉眼不易分辨的弱带计为“0”，建立原始矩阵。使用SPSS18.0软件分析其Jaccard遗传系数，采用UPGMA法进行测试样本的聚类分析，建立聚类树状图。

作者贡献
陈志丹、李振刚和孙威江是本研究的实验设计和实验研究的执行人；陈志丹、李振刚完成数据分析，论文初稿的写作；孙威江是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家科技部科技项目(2010DFB330304, S2011C400031, 2011BAD01B01)和福建省农业科技重大项目(2011N5006)共同资助。

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