Identification and Expression of Universal Stress Protein (USP) Genes in Banana (Musa acuminata L. AAA group, cv. Cavendish)

Wang Xia ^1,2　Lin Qiumei ²　Zhao Dongfang ²　Jia Caihong ²　Wang Jingyi ²　Liu Juhua ²　Huang Mianjia ¹　Cong Xinli ^1*　Wang Zhuo ^2*

1 College of Life Science and Pharmacy, Hainan University, Haikou, 570228; 2 Key Laboratory of Tropical Crop Bioscience and Biotechnology, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, 571101

* Co-corresponding authors, wangzhuocd@126.com, cong0890@163.com

Abstract　The universal stress proteins (Universal Stress Protein, USP) are conserved stress-responsive proteins in various organisms that are involved in response to biotic and abiotic stresses, but the function of most USP in plants is unknown. In this study, there are identified 53 genes in the Musa acuminata genome. The phylogenetic analysis indicated that these MaUSPs were divided into four subfamiles which the subfamily A, B, C and D. All MaUSPs have USP conserved domains. The distribution mapping results showed that a total of 52 MaUSPs were located on the 11 chromosomes in Musa acuminata genome, which were named MaUSP01 to MaUSP52, based on their chromosomal locations. Ma00_t00840.1 was not anchored on the chromosome, and named MaUSP53. The gene duplication events showed that six pairs of MaUSPs were located in collinear fragments, and segment duplications might be the only way for the expansion of MaUSPs. RNA sequencing (RNA-seq) data indicate that most MaUSPs showed constitutive expression during banana fruit development and ripening-specification. Under drought, low temperature and salt stress, MaUSP08, MaUSP47 and MaUSP49 were significantly expressed that may be involved in banana response to abiotic stress. Under Foc TR4 stress, MaUSP03, MaUSP25, MaUSP39, MaUSP06, MaUSP08, MaUSP24, MaUSP17, MaUSP48 and MaUSP49 genes were significantly down-regulated in Cavendish and up-regulated in GCTCV-119, indicating that MaUSPs may play an important role in banana resistance to banana wilt. These results suggest that these MaUSPs may be important candidate genes in banana fruit quality formation and response to stresses. This study providing a basis for the function analysis the roles of MaUSPs gene in banana during fruit quality formation and response to stresses.

Keywords　Banana, Universal stress proteins, Abiotic stress, Biotic stress, Gene expression

香蕉(Musa spp.)是热带和亚热带地区的粮食和经济作物之一。香蕉果实富含蛋白质和碳水化合物，具有重要的经济价值，对世界各地人民的收入有巨大贡献(Aurore et al., 2009)。香蕉在生长发育过程中会受到许多非生物胁迫和生物胁迫的影响，如干旱(Mahajan and Tuteja, 2005)、低温(Kang et al., 2013)、盐(Munns, 2005)和香蕉枯萎病(D'Hont et al., 2012)等，从而影响香蕉果实的产量和品质。香蕉枯萎病是香蕉生产中的瓶颈问题，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. Cubense, Foc)引起的毁灭性土传维管束病害，其中4号生理小种(Foc TR4)对香蕉主栽品种巴西蕉(M. acuminata AAA group cv. Cavendish)的危害最大(Ploetz, 2006; Visser et al., 2010)。尽管已经通过筛选体细胞组培变异获得抗病性较强的突变体GCTCV-119 (M. acuminata L. AAA group, cv. GCTCV-119) (Hwang and Ko, 2004)，但任然无法满足当前香蕉产业的需求，且目前还没有有效的预防和防控香蕉枯萎病的措施(Ploetz, 2015)，因此挖掘重要的抗胁迫相关基因是当前重要的工作。

广谱胁迫蛋白(Universal Stress Protein, USP)是一种古老而保守的蛋白质。USP不仅存在于细菌的基因组中，也存在于古生菌、真菌、原生生物、植物和动物的基因组中，其表达受到多种胁迫的影响(Vanbogelen et al., 1990; Sauter et al., 2002; Kvint et al., 2003; Aravind et al., 2010; Foret et al., 2011; Vollmer and Bark, 2018)。USP最早在大肠杆菌(Escherichia coli) W3110 K-12菌株中被发现(Vanbogelen et al., 1990)。USP属于丝氨酸和苏氨酸的自磷酸化蛋白，是GTP和ATP的磷酸盐供体(Freestone et al., 1998)。在大肠杆菌中，USP基因被分为6组：uspA、uspC、uspD、uspE、uspF和uspG (Gustavsson and Nyström, 2002)。根据序列的相似性，USP基因可分为两个亚家族：uspA亚家族包括uspA、uspC和uspD；uspFG亚家族包括uspF和uspG。在植物中，将拥有与细菌相似的USPA结构域(大肠杆菌USPA)的基因定义为USP基因(Kerk et al., 2003)，在植物中，USP的功能研究较少。

广义上USPs可分为两组：第一组USPs与没有ATP结合活性的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的uspA结构相似；第二组USPs与詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)中具有ATP结合活性的uspFG型蛋白结构相似。USP蛋白最小的只有一个USP结构域；也有包含两个USP结构域串联重复或与其他功能结构域(如Na+/H+交换剂, 氨基酸渗透酶和蛋白激酶)一起存在，形成较大的蛋白(Kvint et al., 2003)。

迄今为止，在不同植物中已有多个USP基因被研究，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Lycopersicon esculentum)、水稻(Oryza sativa)、棉花(Gossypium spp)、黄芪(Astragalus sinicus)、大麦(Hordeum vulgare)、丹参(Salvia miltiorrhiza)、木豆(Cajanus cajan)和烟草(Nicotiana tabacum) (Zegzouti et al., 1999; Sauter et al., 2002; Kerk et al., 2003; Chou et al., 2007; Li et al., 2010; Merkouropoulos and Tsaftaris, 2013; Sinha et al., 2016; Udawat et al., 2016; Gutierrez-Beltran et al., 2017; Wang et al., 2017)。研究表明，USP基因可提高在胁迫下的细胞存活率，从而提高植物抗逆性(Zahur et al., 2009)。在番茄中，ER6 (Ethylene-regulated gene)与USP高度相似，可以被乙烯诱导(Zegzouti et al., 1999)。水稻OsUSP1在水分胁迫和乙烯处理中上调表达(Sauter et al., 2002)。在紫云英中，USP基因在感染根瘤菌的根中被诱导表达(Chou et al., 2007)。亚洲棉的GUSPl和GUSP2可以响应水分胁迫(Zahur et al., 2009)。在木豆(Cajanus cajan L.)中发现了4个类似uspA的基因响应干旱胁迫(Sinha et al., 2016)。拟南芥AtUSP重组蛋白具有抗真菌活性，能够抑制多种病原真菌的生长(Jung et al., 2015)。在烟草中过表达苜蓿MfUSP1可增强其对低温、干旱、盐等非生物胁迫的耐受性(Gou et al., 2020)。过表达SbUSP (Salicornia brachiata)可增强烟草的耐盐性和耐旱性(Udawat et al., 2016)。到目前为止，香蕉的USP基因还未见报道。

香蕉A基因组已经完成测序，为MaUSPs基因全基因组分析提供了数据支持(France et al., 2012)。由于USP基因已被证明与许多植物物种的抗逆性有关，本研究对MaUSPs基因家族进行系统鉴定，分析其在果实发育和成熟以及胁迫响应中的作用，为进一步针对这些基因作为遗传改良靶点提高香蕉果实品质和抗逆能力提供了遗传资源。

1结果与分析

1.1 MaUSP基因的鉴定和分类

利用香蕉A基因组网站获得全部MaUSPs成员的蛋白序列，使用SMART对其进行蛋白结构域预测，共鉴定出53个香蕉USP基因(MaUSPs)。根据其在染色体上的位置将其命名为MaUSP01至MaUSP52，Ma00_t00840.1未锚定在染色体上，命名为MaUSP53。详细的MaUSP蛋白序列位置(表1)。MaUSP蛋白的长度包含158~817个氨基酸不等；等电点分析表明MaUSP蛋白序列等电点差异明显，分布在4.88~10.95 之间；分子量分布在16.9~90.89 kDa之间(表1)。亚细胞预测结果表明MaUSPs分别定位于细胞核(20个)、细胞质(14个)、叶绿体(9个)、线粒体(6个)、细胞外(3个)、细胞质膜(1个)，说明不同MaUSPs基因成员间可能具有不同的功能(表1)。

1.2 MaUSPs系统发育分析

为研究MaUSPs的进化关系，以拟南芥的26个USP蛋白序列与香蕉53个USP蛋白序列构建系统进化树。利用MEGA6.0软件中的比邻法构建系统进化树，采用poisson model计算进化距离。结果显示，MaUSPs可分为4个亚家族：其中A亚家族包含24个成员，是最大的亚家族；B亚家族最小，只包含一个成员；C亚家族和D亚家族，分别有16和12个MaUSPs(图1)。

1.3 USP结构域中的保守氨基酸残基

使用SMART预测发现53个MaUSPs蛋白序列都含有USP结构域。根据MJ-0577的晶体结构，通过ClustalW align和weblog visualization发现6个保守结构域，如保守的ATP腺嘌呤(A)、ATP磷酸(P)或ATP核糖(R)或位于二聚结构域(D) (图2A; 图2B; 图2C; 图2D)。在这些USP结构域中，MaUSPs的保守程度不高。根据蛋白结构，UspA蛋白家族主要分为两个亚群：一个含有ATP结合位点结构域，另一个无ATP结合位点结构域(Tkaczuk et al., 2013)。此外，并非所有MaUSPs基因都含有甘氨酸(G)，在53个MaUSPs的USP结构域的168个氨基酸位点上，只有23个位点具有完整的ATP结合保守结构域的特异结合序列(G-2x-G-9x-G[S/T]) (图2E)。

1.4 MaUSPs的染色体定位和基因重复

根据MaUSPs在香蕉A基因组数据库中的位置确定其在染色体上的相对分布。染色体定位分析表明，共有52个MaUSPs分布在11条染色体上。MaUSPs分布在11条香蕉染色体上(图3)，但其分布是不均匀的；其中2号染色体上分布的MaUSPs数量最多，3号和6号染色体上有8个MaUSPs，5号、9号和11号染色体上分别有4个MaUSPs，1号和2号染色体上有3个MaUSPs，还有2个分别位于10号和7号染色体上。

片段重复、串联重复和反转录是基因家族扩增的关键因素(Hurles, 2004; Freeling, 2009)。根据香蕉A基因组的节段性片段信息，在本研究中发现12个共线的MaUSPs位于共线区，属于片段重复(图3)；在系统进化树中，共线区大部分共线MaUSPs属于同一类群；MaUSP48和MaUSP28在系统进化树中分布在不同的位置(图1)，有可能是因为MaUSP48和MaUSP28在很早以前就已经进行了基因重复，这些基因的序列和功能在进化过程中发生了显著的分化；本研究未发现属于串联复制和反转录的成员。上述结果表明在香蕉A基因组进化过程中，MaUSPs扩增主要是通过片段重复。

1.5 MaUSPs在果实发育和采后成熟中的表达谱

对巴西蕉果实发育和采后成熟的5个时间点0 DAF (Day After Flower)、20 DAF、80 DAF-0 DPH (Day Poster Harvest)、8 DPH和14 DPH的RNA-seq数据进行分析，过滤掉上述5个时间点RPKM均小于5的MaUSPs成员。我们获得28个RPKM>5的MaUSPs成员(图4)，占52.8%，表明MaUSPs基因家族成员在香蕉果实发育和采后成熟过程中表达活跃。其中，在果实发育阶段(0 DAF、20 DAF和80 DAF)，MaUSP49、MaUSP33、MaUSP46、MaUSP17、MaUSP24、MaUSP14、MaUSP28、MaUSP03、MaUSP47、MaUSP48、MaUSP45、MaUSP29的RPKM值均大于20，最高的RPKM值为339；这些MaUSPs成员在果实采后成熟阶段(0 DPH, 8 DPH和14 DPH)显著表达，RPKM值最高达855，说明这些MaUSPs成员在果实发育和采后成熟阶段组成型表达；

进一步分析发现MaUSP49、MaUSP24的表达量在香蕉果实发育和采后成熟阶段均显著表达(RPKM>55)，说明这些成员可能在香蕉果实和采后成熟过程中起着重要的作用。值得关注的是，我们还发现MaUSP17、MaUSP29基因在果实采后成熟过程中特异高表达，尤其在8 DPH和14 DPH两个时间点(RPKM>800) (图4)，说明MaUSP17、MaUSP29可能特异地参与香蕉果实采后成熟过程。

1.6 MaUSPs在香蕉幼苗经低温、干旱、盐处理后的表达谱

在低温处理(Cold, 4℃)条件下，8个MaUSPs差异表达，其中MaUSP05、MaUSP08、MaUSP47、MaUSP49显著上调(log2^{(Cold/Control)}>1)，MaUSP14、MaUSP31、MaUSP03、MaUSP35显著下调。在干旱处理(Osmoti, 200 mmol/L mannitol)条件下，10个MaUSPs差异表达(log2^{(Cold/Control)}>1)，其中MaUSP17、MaUSP29、MaUSP28、MaUSP08、MaUSP47、MaUSP49显著上调，MaUSP48、MaUSP31、MaUSP03、MaUSP35显著下调(图5)。在盐(Salt, 300 mmol/L NaCl)处理后，7个MaUSPs差异表达(log2^{(Cold/Control)}>1)，其中MaUSP17、MaUSP29、MaUSP08、MaUSP47、MaUSP49显著上调，MaUSP48、MaUSP03显著下调；MaUSP08、MaUSP47和MaUSP49在低温、干旱、盐胁迫下都显著表达；上述结果表明MaUSPs可能参与响应香蕉抵抗逆境胁迫的过程。

1.7 MaUSPs在香蕉幼苗经Foc TR4处理后的表达谱

12个MaUSPs在抗病品种GCTCV-119 (作图简写为GCT)和感病品种巴西蕉(作图简写为BX)接种Foc TR4之后差异表达，其中在巴西蕉2DPI时，12个MaUSPs基因全部显著下调；GCTCV-119 2DPI时，除MaUSP03、MaUSP25和MaUSP39下调表达，MaUSP03、MaUSP25、MaUSP39、MaUSP06、MaUSP08、MaUSP24、MaUSP17、MaUSP48和MaUSP49基因均显著上调(图6)。上述结果表明，MaUSP03、MaUSP25、MaUSP39、MaUSP06、MaUSP08、MaUSP24、MaUSP17、MaUSP48和MaUSP49可能参与香蕉抗香蕉枯萎病的过程。

2讨论

USP是在各种生物体中保守的应激反应蛋白，参与响应生物和非生物胁迫。UspA超家族最早在大肠杆菌中被发现，在多种应激和胁迫条件下，其表达量急剧增加(Vanbogelen et al., 1990)。在植物基因组中，USPs的数量一般只有20~50个成员，如在木豆、拟南芥、丹参和大麦中分别鉴定出51个、42个、32个和16个USPs，而在甘蓝型油菜(Brassica napus)中发现142个USP成员。在香蕉中我们鉴定出53个USPs，数量仅次于甘蓝型油菜。MaUSP蛋白的长度包含158~817个氨基酸不等，等电点分布在4.88~10.95之间，分子量分布在16.9~90.89 kDa之间(表1)，且所有的MaUPSs都包含USP结构域；这些特征与其他植物USP蛋白的特性一致(Zahur et al., 2009; Tkaczuk et al., 2013)。根据其结合ATP的能力将uspA家族成员分为两大类(Tkaczuk et al., 2013)，本研究在23个MaUSPs中发现了高度保守的ATP特异结合位点(G-2X-G-9X-G[S/T]) (图2)，所有的MaUSPs都属于USP基因。亚细胞定位预测结果显示，53个MaUPSs的位置不同，说明MaUPSs的功能可能不同，该结果与丹参的研究结果一致(Wang et al., 2017)。系统发育分析表明，53个MaUSPs分为A、B、C、D亚家族，这与拟南芥和丹参的结果一致(Kerk et al., 2003; Wang et al., 2017)。香蕉A基因组共经过了3次全基因组重复事件(α-, β-, and γ-WGD)，祖先共线性区块的片段重复区域占222 Mb，包含26 829个基因(France et al., 2012)。本研究发现12个MaUSPs位于上述片段重复区块中(图3)，表明片段复制是MaUSPs基因家族扩张的主要方式。

香蕉的发育和成熟过程是香蕉品质形成的一个重要的过程。呼吸跃变型果实的发育和成熟是一个氧化过程，会产生活性氧(ROS)，如超氧自由基(O2⁻)和过氧化氢(H₂O₂) (Mondal et al., 2004; Pandey et al., 2013)。番茄ER6是广谱胁迫蛋白家族的一员，在诱导果实成熟过程，番茄完熟期的表达谱达到高峰(Zegzouti et al., 1999)。本研究发现，在果实发育和成熟过程中，大部分的MaUSPs基因表达量较高，其中MaUSP46、MaUSP33和MaUSP49在果实发育期的表达量较高，MaUSP24、MaUSP49、MaUSP14、MaUSP28基因在采后成熟时期差异显著(图4)，表明这些MaUSPs在香蕉发育和采后成熟中起着重要作用。

USP蛋白存在于古生菌、真菌、原生生物、植物和动物中(Sauter et al., 2002; Foret et al., 2011)。在大肠杆菌中，uspA在营养耗尽和DNA损伤的生长抑制过程中会显著增加(Gustavsson and Nyström, 2002)。在植物中，USP基因参与响应多种非生物胁迫(Jung et al., 2015; Udawat et al., 2016)。水稻OsUSP1在水分胁迫和乙烯诱导中上调表达(Sauter et al., 2002)。亚洲棉GUSPl和GUSP2可以响应水分胁迫(Zahur et al., 2009)。在红杉(Gossypium hirsutum)中，GhUSP1和GhUSP2参与响应植物发育和盐胁迫(Merkouropoulos and Tsaftaris, 2013)。在本研究中，大多数MaUSPs在干旱、低温和盐等非生物胁迫下差异表达(图5)。这些结果表明，MaUSPs可能在香蕉幼苗对非生物胁迫的反应中起重要作用。

USP基因在参与植物响应生物胁迫的过程中也有着重要作用。紫云英USP通过感染根中的根瘤菌被诱导表达(Chou et al., 2007)。在拟南芥中，USP (At3g53990)具有抗真菌活性，能刺激真菌产生ROS和线粒体损伤。巴西蕉是香蕉主栽品种，易感香蕉枯萎病，而GCTCV-119是抗病突变体。在本研究中，巴西蕉和GCTCV-119接种Foc TR4后，12个MaUSPs差异表达，在巴西蕉中，MaUSPs基因的表达被显著抑制，但在GCTCV-119中MaUSP03、MaUSP25、MaUSP39、MaUSP06、MaUSP08、MaUSP24、MaUSP17、MaUSP48和MaUSP49基因均显著上调(图6)；上述结果表明MaUSPs基因可能在响应香蕉抗枯萎病的过程中可能起着重要作用。

3材料与方法

3.1 MaUSPs鉴定和系统发育分析

本研究从香蕉A基因组网站(http://musagd.biocloud.net/home)下载香蕉A基因组DH Pahang v2编码蛋白序列的所有基因(Martin et al., 2016)；利用拟南芥的所有USPs进行BLAST搜索，检索香蕉A基因组中心数据库中预测的MaUSPs；利用ExPASy数据库(http://expasy.org/)预测MaUSPs的分子量和等电点；利用Plant-mPLoc Server (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plantmulti/)在线预测MaUSPs蛋白亚细胞定位；利用NCBI和SMART (https://smart.embl.de/)对所有候选的MaUSPs蛋白序列进行BLASTp。拟南芥的MaUSPs蛋白序列来自TAIR (http://www.arabidopsis.org/)数据库；利用ClustalW对香蕉和拟南芥的全长MaUSPs蛋白序列进行比对；利用MEGA X软件，采用邻接法构建进化树(Audic and Claverie, 1997)。已上传的MaUSPs的登录号(表1)。

3.2染色体分布和基因重复

为确定MaUSPs的染色体分布情况，从香蕉A基因组数据库中获取每条染色体上所有基因的起始和终止位置，并按照11条染色体的位置按比例绘制。根据植物基因组复制数据库(plant genome duplication database, PGDD)的方法(Lee et al., 2012)进行序列重复和片段重复。基于染色体定位确定串联重复的标准：在单个染色体上的同源的MaUSP基因，如果没有其他干预基因，且彼此之间相距30 kbp以内，被鉴定为串联重复(Shiu and Bleecker, 2003; Du et al., 2013)。使用MCSCAN(参数: -a-e1e-5-s5)检测Syntenic (Wang et al., 2019)，提取Syntenic中所有的MaUSP基因。利用Circos (0.63)软件绘制出MaUSP基因的位置和合成图像(http://circos.ca/)。

3.3植物材料和处理

巴西蕉(Musa acuminata L. AAA group, cv. Cavendish)果实取自热带生物技术研究所蕉园(海南澄迈, 20N, 110E)。分别采集了0 DAF (Day After Flower)、20 DAF、80 DAF-0 DPH (Day Poster Harvest)、8 DPH和14 DPH的果实。

选取苗龄为一个月的巴西蕉幼苗，使用Hoagland溶液进行浇灌(0.51 g/l KNO₃, 0.82 g/l Ca(NO₃)₂, 0.49 g/l MgSO₄·7H₂O, 0.136 g/l KH₂PO₄, 0.6 mg/L FeSO₄, 2.86 mg/L H₃BO₃, 1.81 mg/L MnCl₂·4H₂O, 0.08 mg/L CuSO₄·5H₂O, 0.22 mg/L ZnSO₄·7H₂O, 0.09 mg/L H₂MoO₄·4H₂O) (pH 6.0)作为对照，在干旱(osmotic, 200 mmol/L mannitol)、盐(salt, 300 mmol/L NaCl)、低温(cold, 4℃)对香蕉苗进胁迫处理7 d；温室的最高温度和最低温度分别为25℃和30℃，相对湿度在55%~80%之间。

选取五叶一心的感病品种巴西蕉(作图简写为BX)和抗病品种GCTCV-119 (作图简写为GCT)使用蘸根法接种Foc TR4 (Hwang and Ko, 2004)，孢子浓度为1.5×10⁶孢子/mL，在接种后0 d、2 d、4 d和6 d (DPI)用液氮冻存香蕉根部组织，存于-80℃备用(Lee et al., 2012)。

3.4转录组分析

使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取香蕉根系总RNA，RNA用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(ThermoFisher Scientific)反转录为cDNA，存于-20℃备用。使用TruSeq RNA文库制备试剂盒v2构建cDNA文库，随后使用Illumina RNA-seq协议在Illumina HiSeq 2000平台上进行测序。对每个样本进行两次生物重复。基因表达水平以每百万Reads中基因每千碱基长度的Reads数(RPKM)计算(Mortazavi et al., 2008)。采用每个基因读数为2个重复(fold change≥2; FDR≤0.001)。所有数据已上传至CNGBdb的CNSA (https://db.cngb.org/cnsa/)存储，其登录号为CNP0000292。MaUSPs基因在果实中的数据用RPKM值表示；在胁迫条件下的数据用Log值表示，利用MeV v 4.3作图。

作者贡献

王卓和从心黎是本研究的实验设计者；王霞是实验研究的执行人，并完成数据分析、论文初稿的写作；林秋妹、赵东方、贾彩红、王静毅、刘菊华和黄绵佳参与实验设计、试验结果分析；王卓和从心黎是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由海南省自然科学基金(No.318MS090)和CATAS (No.1630052019035)共同资助。

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