桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)、杯果木属(Angophora)和伞房桉属(Corymbia)树种的简称，共有808种和137个变种(Hill and Johnson, 1995)。桉树的天然分布主要是澳大利亚、巴布亚新几内亚和印度尼西亚及其附近岛屿，因其具有速生、丰产、适应性广和用途多样等特点，在热带和亚热带地区广为引种，全球人工桉树林面积已达1 780万公顷以上(FAO, 2000)。

简单序列重复(simple sequence repeats, SSR)，或称微卫星，在基因组中数量众多，作为分子标记具有重复性好、共显性和变异性高等特点(Tauz, 1989; Powell et al., 1996)，在生物学有关研究中应用广泛(方宣钧等, 2001)。目前，桉树上已开发的SSR标记相对较少，包括367个基因组SSRs (Brondani et al., 2006)、35个叶绿体SSRs (Steane et al., 2005)和20个表达序列标签(expressed sequence tag, EST) SSRs，或称EST-SSR(Faria et al., 2010)。其中，EST-SSR因与基因相关，在近缘物种中的通用性较高(Varshney et al., 2005; Ellis and Burke, 2007)，与功能基因的连锁不平衡也可能较强(Ayers et al., 1997)。公共数据库中日益增多的EST序列也为EST-SSR开发提供了便利。截止2010年7月12日GenBank中已有桉属EST序列37 751条(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/?term=Eucalyptus)。分析表明，桉属EST序列约15%含有SSR (李淑娴等, 2010)，非冗余EST序列中25%以上含有SSR (Rabello et al., 2005; Ceresini et al., 2005)。

虽然，在许多物种中开展了EST-SSR标记开发研究，但极少确认聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)产物与源EST序列的一致性。据我们所知，只有3篇报道进行了部分EST-SSRs的序列确认，包括鹰嘴豆(Cicer arietinum L.) 60个EST-SSR标记中的5个(Choudhary et al., 2009)、生菜(Lactuca sativa L.) 61个标记中的30个(Simko, 2009)和茶树(Camellia sinensis L.) 61个标记中的部分标记(Sharma et al., 2009)。由于引物的低特异性可能导致PCR错误扩增，从而产生非目的片段或假阳性片段(Cha and Thilly, 1995; Kunkel and Bebenek, 2000; 张晓红等, 2009)，因此，对于包括SSR在内的序列标签位点(sequence tagged site, STS)的序列确认是非常必要的。

PCR产物一般可以通过两种方法测序，即直接测序和克隆后的菌落测序。前者操作上相对快捷，但当PCR产物不纯时测序结果较难判读(张晓红等, 2009)；后者针对单菌落测序，模板单一，可以获得理想的测序结果，尤其是可以获得PCR产物的完整序列，但需要进行克隆转化，增加了实验的成本以及工作量。因此，如何选择合适的测序方案以保障测序质量、控制实验成本和提高实验效率，是EST-SSR标记开发和其它PCR产物测序的一个关键问题。
本研究以1株细叶桉(E. tereticornis Smith)为材料，比较了桉树EST-SSR标记开发中PCR产物直接测序和混合克隆测序的效果，以期获得高效、经济的EST-PCR产物测序方案。同时，开发了一批桉树EST-SSR标记，有助于增加桉树的分子标记资源。

1结果与分析
1.1桉树32对EST-SSR引物的PCR扩增
为了在混合克隆后可以通过单菌落PCR产物查找长度对应的EST-PCR产物，并且避免对插入片段相同、菌落PCR产物长度亦同的菌落的重复测序，候选32对桉树EST-SSR引物对1株细叶桉(P₂) DNA扩增的产物大小尽量不同，介于120 bp和1 500 bp之间(图1)。PCR产物基本都是单一、明亮的谱带，少量PCR产物具有较弱的杂带(图1中27, 29和31号)。另外，32对EST-SSR引物中，有的PCR产物大小与设计的EST长度相符，有的明显大于设计的EST长度(表1)。

图1 桉树32对EST-SSR引物对1株细叶桉(P2)的PCR扩增产物 Figure 1 PCR products amplified from the tested eucalyptus P2 using 32 EST-SSR primer pairs

1.2桉树32对EST-SSR引物的PCR产物的直接测序
32个EST-SSR对P₂的PCR产物直接测序中，成功测序的有21个(表1)，比例为65.6%。其中，4个EST-SSR (03, 08, 20和22号)的简单重复序列邻近测序引物，未能确认完整的重复单位数，因毛细管测序中引物序列后一般有20 50 bp不能测出。成功测序的21个EST-SSR中，P₂的2个等位片段间在长度上纯合的标记有13个，杂合的有8个(08, 11, 13, 17, 18, 20, 22和28号)，其中18号的杂合性是由于单个碱基重复数的变异所致(表1)。对于长度杂合的SSR标记，PCR产物直接测序峰图中重复单位变异后出现双峰(单峰也是双峰叠加的结果)。图2和图3A分别显示了P₂中等位片段长度纯合标记EUCeSSR1135 (06号)和杂合标记EUCeSSR0946 (13号)的重复单位及其与源EST的对比。

图2 在P2中片段长度纯合的标记EUCeSSR1135 (06号)的部分序列及其与源EST的对比 Figure 2 Partial sequences of the length-homozygous EST-SSR marker EUCeSSR1135 (No. 06) within P2 and their comparison to the original EST

表1  候选32个桉树EST-SSR的引物以及对细叶桉(P2)的PCR序列确认 Table 1 Primer pairs and sequence validation for the 32 candidate EST-SSRs of Eucalyptus

图3 在P2中片段长度杂合的标记EUCeSSR0946 (13号)的部分序列及其与源EST的对比 Figure 3 Partial sequences of the length-heterozygous EST-SSR marker EUCeSSR0946 (No. 13) within P2 and their comparison to the original EST

另外，片段长度纯合的13个标记中，有7个(02, 03, 04, 05, 10, 14和23号)在P₂的2个等位片段间存在至少1个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，或称个体内SNP。

1.3 EST-PCR产物的混合克隆测序
在8个、16个、24个和全部32个EST-SSR对细叶桉P₂扩增产物的混合克隆测序中，测序成功的标记数分别为6个(75.0%)、11个(68.8%)、11个(45.8%)和14个(43.8%) (表1)。可见，随着混合克隆的EST-PCR产物数量的增加，虽然测序成功的标记数量呈增加的趋势，但比例却逐渐下降。其中，16个PCR产物混合克隆的成功测序的标记数量较大、比例也较高。

不同数量PCR产物混合克隆共成功测序19个标记(表1)。与PCR产物直接测序相比，有6个标记(15、16、26、27、29和30号)只在混合克隆测序中被测到，包括2个片段长度杂合标记(15和29号)和1个长度纯合、含有个体内SNP的标记(26号)；但有8个PCR产物直接测序成功的标记(5, 9, 10, 11, 14, 17, 18和19号)在混合克隆后没有被测到。

混合克隆的单菌落测序的峰图比较“干净”(图3B和C)，有利于查找SSR的位置和数量；但对于长度杂合的EST-SSR标记，单菌落测序只能测到一个等位片段。本研究中，由于有的杂合标记参加了不同数量的PCR产物混合克隆，刚好不同的等位片段均被测序，如8、13、20、22和29号(表1)。

混合克隆测序中也发现了一些“误扩增”片段，即引物序列同某一个EST，但序列的长度与相应的PCR产物不同、且与源EST的序列一致性很低。该类片段可能为非特异性扩增所致，因长度刚好类似于另一个EST-PCR产物而被测序。

1.4桉树EST-SSR标记的开发
结合对细叶桉P2的PCR产物直接测序和混合克隆测序，共确认了27个桉树EST-SSR的序列，与源EST比对的一致性介于90.23%和100%之间(表1)。其中，在P2中片段长度杂合的标记10个、纯合的17个；在长度纯合的17个标记中，有8个(02, 03, 04, 05, 10, 14, 23和26号)存在1个以上的个体内SNP。

2讨论
目前，新一代的测序技术已有广泛的应用(Mardis, 2008)，但传统的末端终止法仍是普遍使用的测序技术(周德贵等, 2008)，尤其是针对小规模的目的序列的测序，如EST标记开发中的EST-PCR产物测序。因此，如何经济、快捷和高效地进行末端终止法测序仍然具有极为重要的应用价值。

PCR产物直接测序具有快速、简便和低成本的优点(徐祖元等, 2002; 张晓红等, 2009)；并且，对于二倍体的DNA模板，可以同时测出2个等位片段(虽然存在插入/缺失时后面测序峰会出现双峰)。但是，因技术限制，PCR产物直接测序时前面3 040 bp左右往往遗失(苑克俊等, 2007)，这不利于完整序列的确认，尤其是目的序列靠近测序引物位置时，如本研究中SSR重复单位未能完整判读的4个标记；并且，当DNA模板的引物结合序列发生变异时，引物特异性较差将导致非特异性PCR产物的产生，测序的峰图较乱，影响测序结果判读的准确性(张晓红等, 2009)，这也是本研究中尚有11个(34.4%)扩增较好的EST-SSR标记未能成功测序的主要原因。因此，PCR产物直接测序主要应用于扩增特异性好、测序引物后面的几十个碱基不需完整确认的序列。

克隆测序可以克服PCR产物直接测序的不足，获得完整序列(毛伟华, 2005)。但是，以往的克隆测序多是针对单个PCR产物，这在待测样品较多时需要花费大量的经费和人力进行克隆转化，因此多个PCR产物混合克隆应是一个不错的选择。本研究中混合克隆测序的成功率为43.8~75.0%，并且有6个标记只在混合克隆中被成功测序，证明了混合克隆测序的有效性。

比较8个、16个、24个和32个EST-PCR产物混合克隆后的测序成功率，兼顾克隆转化与测序的效率、成本和时间，我们推荐16个EST-PCR产物混合克隆为最好的选择。混合克隆的PCR产物太少，克隆转化的成本较高、耗时也较多。PCR产物太多，非特异性扩增的谱带数增加(虽然切胶回收法可以解决这一问题，但增加成本和人力)，菌落PCR后通过片段长度查找对应的PCR产物时易与长度近似的目的片段混淆，从而造成测序的浪费，如本研究32个EST-PCR产物的混合克隆中32次测序只确认了14个标记；并且，PCR产物增多，产物间长度差别相对较小，菌落PCR后通过琼脂糖凝胶电泳不易准确查找对应长度的EST-PCR产物(尤其对于长片段)。当然，在实际实验中，再挑取更多的菌落测序可以获得更多的标记，但增加了菌落PCR与测序的工作量和成本。

目前，已发表的桉树EST-SSR标记只有20个，且未进行测序确认(Faria et al., 2010)。本研究共开发了与源EST序列一致性好的27个桉树EST-SSR标记(表1)，这将显著增加桉树的分子标记资源。并且，27个标记中，在P₂中存在片段长度杂合的标记有10个、存在个体内SNP的标记有8个，这些标记将在以P₂为父本的遗传图谱构建群体中分离，从而有效用于遗传图谱构建。这也表明在桉树中开发基于EST的分子标记具有极大潜力。

3材料与方法
3.1实验材料与DNA提取
1株细叶桉(P₂)是Gan等(2003)遗传图谱构建群体的父本。DNA提取参考CTAB法(Doyle and Doyle, 1991)，稍做改进，即在CTAB提取液中加入5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2%的-巯基乙醇。pGEM^®-T Easy载体及JM109大肠杆菌感受态细胞购自Promega公司。

3.2 EST序列、引物序列和PCR
桉树EST序列下载自GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbEST/)，截止2009年1月2日共有35 643条。利用PHRAP软件(http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)拼接后，通过MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)查找简单序列重复，标准为：2、3和4碱基重复的最短长度为12 bp，5和6碱基为15 bp。包含SSR的序列用于EST-SSR引物设计，软件为Primer Premier 5.0 (http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html)，标准为：引物长度18~22 bp (最佳20 bp)，Tm 55~65℃ (最佳60℃)，GC含量40~60 %，目的片段长度100~500 bp。引物合成委托上海Invitrogen公司完成。

利用细叶桉(P₂) DNA进行EST-SSR引物的PCR条件优化，主要针对PCR体系的Mg²⁺浓度和PCR程序的退火温度。PCR优化后，选择PCR产物长度不同的32个EST-SSR进行测序实验，引物序列和PCR产物大小见表1。PCR体系和PCR程序参考张晓红等(2009)，退火温度均为56℃，但10×Buffer中Mg²⁺浓度改为15或20 mmol/L。

3.3 PCR产物纯化和直接测序
PCR产物经乙醇-醋酸钠法纯化后直接测序(张晓红等, 2009)，测序一般利用前向引物，对较长片段也利用后向引物测序。测序采用20 μL体系，参考Bigdye Terminator V3.1操作手册(Applied Biosystems Co.)，但测序试剂Bigdye用量为0.5 μL。测序仪为ABI 3130xl，数据收集利用软件Data Collection 2.0，序列查看和分析利用软件Sequencing Analysis 5.2。所测序列与目标EST序列的比对利用软件DNAMAN V5.2.2 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)。

3.4 PCR产物的混合克隆和测序
对于候选32个桉树EST-SSR标记，按照对细叶桉P₂扩增产物长度的相互差别尽量较大的原则，分别选取8个(04, 06, 08, 12, 15, 17, 22和26号)、16个(01, 04, 06, 08, 10, 11, 13, 16, 17, 20, 22, 23, 24, 26, 28和29号)、24个(去除02, 05, 09, 13, 14, 18, 22和32号)以及全部32个标记的PCR产物进行等摩尔混合，并利用载体pGEM^®-T Easy (Promega)进行克隆、通过热激法转化JM109感受态细胞，转化细胞在含有X-gal/IPTG的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选。操作过程按照试剂盒的说明。

从培养平板上挑取6倍于原PCR产物数量的阳性菌落进行PCR，引物为pUC/M13-F (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3')和pUC/M13-R (5'-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3')。PCR体系参考张晓红等(2009)，但10×Buffer中Mg²⁺浓度为20 mmol/L；PCR程序为95℃ 5 min，再30个循环：94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 3 min，最后72 ℃ 10 min。根据菌落PCR产物大小(减去载体序列253 bp)确定最可能对应的原EST-PCR产物，针对各个最可能插入了原EST-PCR产物的菌落进行测序，即各批测序的克隆数等于混合的标记数量。测序过程参考前3.3。所测序列与目标EST序列的比对利用软件DNAMAN V5.2.2 (Lynnon Biosoft)。
 
作者贡献
周长品和李发根是本研究的实验设计和实验研究的执行人；翁启杰和于晓丽及李梅参与实验执行以及结果分析；甘四明是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31070592)、广东省自然科学基金(10151052001000000)、国家高技术研究发展计划(863计划)重点项目(2006AA100109)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(RITFKYYW2008-4和2010-04)共同资助。

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