自1973年杂交水稻实现“三系”配套以来，恢复系的综合性状在决定一个杂交水稻品种应用推广中起着至关重要的作用(钱前, 2007)。近年来，随着研究的不断深入，亲本选配中少量优良核心种质的反复利用和人工定向选择致使大多数优良性状集中于少数亲本材料上，遗传改良基础日趋狭窄，许多非育种目标所追求的多样化性状基因丢失，从而进一步导致遗传多样性的下降，一些品种性状各异的亲本组配创制新材料时在后代选择中趋于定向选择，新品种之间的遗传差异越来越小(甘晓燕等, 2009)。育种工作者为快速选育出具有多个优良农艺性状的新品种，常常在原有优良亲本材料的基础上进行杂交改良创制新材料。在加快育种进程的同时，也造成了创制的新品种遗传基础狭窄，对育种水平的进一步提高有极大的局限性(王颖姮等, 2009)。在常规育种中，主要依据育种经验及株型选择来选育新材料，源于同一供体亲本的株系间较难筛选到遗传差异大的种质。复合杂交育种、航天诱变育种等技术能够在一定程度上创造更多的变异类型，丰富遗传基础，但在丰富遗传基础的同时，性状的稳定需更多的世代，甚至加代至高代仍未能稳定性状，给新品种选育带来了新的挑战。

DNA分子标记在研究水稻材料遗传多样性中被广泛应用。其中基于PCR的SSR分子标记快捷简便，重复性好且多态性丰富，在水稻遗传多样性检测中得到广泛应用，此外SSR 标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体，而且结果可靠，方法简单，省时省力(白玉, 2007)。王秋实和何光华(2007)利用64对SSR引物对38份材料进行分析，鉴定到多份遗传差异较大的材料，并提出选用抗病材料与遗传差异大的材料杂交选育新的抗病新品种的策略。段世华等(2002)采用SSR分子标记技术对35份恢复系材料进行遗传多样性分析，结果表明我国杂交水稻恢复系资源丰富但遗传差异较小，遗传背景较为单一。吕广磊等(2009)采用64对SSR标记对96份云南地方品种及选育品种进行比较分析，表明云南栽培稻选育品种与地方品种亲缘关系较近，其遗传基础可能源于云南地方品种，同时也认为云南地方品种遗传多样性丰富，存在大量优质性状可供育种实践选择。因此，如何有效地利用较为丰富的种质资源，创制新材料，提高育种效率是目前急待解决的难题。运用SSR标记技术分析评价复合杂交系谱选育的高代恢复系(8～10代)稳定性及遗传多样性尚未见到报道。本研究采用SSR分子标记技术，对源于诱变、籼粳杂交及复合杂交为一体的高代恢复系材料(8～10代)进行遗传稳定性评价和遗传多样性分析，为进一步利用这些高代恢复系材料进行杂交水稻新组合的配制提供依据并为分子标记技术评价遗传稳定性提供参考。

1 结果与分析
1.1 27份高代恢复系材料的SSR扩增结果
本实验选用水稻新品种鉴定用的24对SSR标记对27份水稻高代恢复系材料进行遗传多样性分析，结果显示所有引物均能扩增出稳定清晰可辨的扩增产物。24对引物共扩增出165条DNA带，其中9对引物具有共38个多态性位点，占总条带的23.03%。每对引物检测出2～8个多态性片段，平均4.2个。每个多态性SSR位点的多态性信息量(PIC)变化范围在0.299～0.866，平均值为0.592 (表1)。图1为引物RM71对供试的27份材料的SSR电泳图，图中所示的具有不同的SSR带型，多态性检测率较高，另从该图也可看出部分株系具有共显性的杂合带型，说明该部分株系材料还有待进一步加代稳定农艺性状。

表1 9对SSR引物在27份高代恢复系材料中检测到的等位变异数和多态性 Table1 Allele numbers and PIC value of 9 SSR loci detected in 27 high generation restorer lines of hybrid rice

图1 SSR引物RM71对27份高代恢复系材料的PCR扩增的电泳图谱; 1～27为高代恢复系材料HA01~27; M为分子量标记 Figure 1 Profile of the amplified products from genomic DNAs of 27 high generation restorer lines of hybrid rice with SSR marker RM71;The number 1~27 is HA01~27 respectively,M indicates DNA maker

1.2 聚类分析
根据9对多态性SSR引物在27份高代恢复系材料中检测到的38个等位基因，采用Ntsys 2.10软件分析了27份高代恢复系材料间的遗传相似系数，用UPGMA法对其进行聚类分析(图2)。27份材料的遗传相似系数在0.95～0.46之间，表现出较为丰富的遗传多样性。当遗传距离以0.46为阀值时，27份高代恢复系材料可分为两类，第Ⅰ类包含有25份材料，第Ⅱ类只含HA02、HA03两份材料。当遗传距离取0.59阀值时，可将此类材料分为三类，第Ⅰ类分布有包含HA01等13个株系，第Ⅱ类中有HA07等12个株系，第Ⅲ类同样只含有HA02、HA03两个株系。从聚类结果上看出，采用复合杂交和系统选育的技术路线，后代可选育出遗传差异较大的株系，为强优势组合的配制和杂种优势的利用奠定基础。

图2 27份高代恢复系材料SSR 标记聚类分析图 Figure 2 The diagram tree of 27 high generation restorer lines of hybrid rice with SSR markers

2 讨论
常规育种中单交只采用两个亲本，其遗传基础相对狭窄，分离后代中较多保留了单一亲本的性状，配制杂交组合，其产量、抗性等农艺性状难以有较大的突破。采用聚合杂交育种，可以聚合多个亲本的优良基因于一体，有利于拓宽和丰富遗传信息。秦学毅等(2006)通过聚合育种选育出多个高抗稻缨蚊品系，实现了抗性基因的重组聚合。

施勇烽等(2005)认为选用12个标记可将不同材料区别开的几率大于99.9%，如果要区别遗传相似性较高的水稻材料，则需要挑选高多态性标记或者增加标记数。本研究选取水稻新品种鉴定的24对SSR引物对具有相似遗传背景的27份高代恢复系材料进行遗传多样性分析和稳定性评价，初步研究结果表明，在所选取的27份材料中，可以选育出具有较大遗传差异的恢复系材料。另外在选育策略上，复合杂交系统法选育，因拓宽了亲本的遗传背景，在稳定农艺性状及聚合多个优良基因上加大了难度，结合分子标记辅助选择，可以对农艺性状相对稳定的品系进行分子水平的评价，有利于加快选育遗传差异大且性状稳定的新材料，进一步拓宽恢复系资源。

多数研究表明，实验中选取的SSR引物对聚类分析的结果有很大影响，肖小余等(2006)提出引物虽然用得越多越好，但存在成本和效率等问题。本实验选取水稻新品种鉴定的24对SSR引物，所选引物对于水稻种质资源多态性筛选具有一定的代表性，能够对27份高代恢复系材料进行较好的多态性评价，成本较低，工作量相对较少，效率较高。通过SSR分子标记筛选得到的具有较大遗传差异的株系在配组杂交组合后，其F1代的综合性状及产量潜力是否能够符合当前生产所需还有待进一步验证。

3 材料与方法
3.1供试材料
选取通过复合杂交(航2号诱变M2/粳稻//优良恢复系亲本明恢63)后代系谱法选择加代至8～10代农艺性状稳定的27份株系(编号HA01-HA27)。

3.2基因组DNA提取
将27份高代恢复系材料各取100粒种子种植至3叶期，每份材料单株取同等大小的叶片混合磨样，采用CTAB法提取水稻基因组DNA。利用BECKMAN DU800检测所提取的DNA浓度及质量，并将DNA浓度统一调整为50ng/µL。

3.3 SSR分析
选取水稻新品种鉴定用的24对SSR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)进行SSR分析(庄杰云等, 2006)。PCR反应体系为10 µL：10×PCR Buffer (Mg²⁺ free) 1 µL，MgCl₂ (2 mmol•µL^-1) 0.6 µL，dNTPs (1 mmol•µL^-1) 0.4 µL，上下游SSR引物(10 umol•µL^-1)各0.25 µL，DNA模板(50 ng•µL^-1) 0.8 µL，Taq酶1 U，不足部分用ddH₂0 补足 (PCR试剂购自Takara公司)，应用BIO-RAD PTC-100 PCR仪进行扩增。反应程序如下：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，重复35个循环，72℃延伸7 min，保存4℃。PCR产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上120V恒压电泳90 min。用荧光染料Genefinder (购于厦门百维信生物科技有限公司)在摇床上染色 20 min，最后在BIO-RAD凝胶成像系统上拍照，记录电泳结果。

3.4 数据分析
标记SSR扩增片段大小，建立1，0数据库，在相同迁移位置上，有带的记为1，无带记为0，缺失的记为9。按照DNA分子标记数据分析方法，将SSR标记作为等位基因进行多态性分析，每扩增得到的一条带记为一个性状，处理数据。SSR位点的多态信息含量PIC=1-∑f_i²计算，fi表示第i位点的基因频率。采用NTSYS2.10数据分析软件进行SHAN聚类分析。

作者贡献
蔡秋华和陈锦文是本研究的执行人；蔡秋华和陈锦文及王颖姮完成数据分析，论文初稿的写作；朱永生、吴方喜、谢鸿光参与实验设计，试验结果分析；张建福和谢华安是项目的构思者、负责人和实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致 谢
本研究由国家“863”项目“高产优质多抗水稻分子品种创制(2006AA100101)”、“强优势水稻杂交种的创制与利用(2009AA101101)”，福建省国家项目配套资金项目(F2006AA100101)和福建省农业科学院创新团队之一项目(STIF-Y04)共同资助，在此表示感谢！

参考文献
Qian Q., 2007, Design breeding of rice gene, Science Press, Beijing, China, pp.6 (钱前, 编著, 2007, 水稻基因设计育种, 科学出版社, 中国, 北京, pp.6)

Gan X.Y., Li M., Guan Y.J., Chen X.J., and Song Y.X., 2009, Genetic diversity of 89 Japonica Rice varieties in Ningxia province by using SSR, Xibei Zhiwu Xuebao(Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 29(9):1772-1778 (甘晓燕, 李苗, 关雅静, 陈晓军, 宋玉霞, 2009, 宁夏89份粳稻种质遗传多样性的SSR分析, 西北植物学报, 29(9): 1772-1778)

Wang Y.H., Zhu Y.S., Wu F.X., Cai Q.H., Liao C.J., Zheng Z., Zheng J.T., Zhang J.F., and Xie H.A. 2009, Genetic diversity analysis with SSR markers for main restorelines of hybrid rice, Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding), 7(2):279-282 (王颖姮, 朱永生, 吴方喜, 蔡秋华, 廖长见, 郑钊, 郑家团, 张建福, 谢华安, 2009, 杂交水稻骨干恢复系的遗传多样性分析, 分子植物育种, 7(2): 279-282)

Bai Y., 2007, DNA molecular marker technology and its applications, Anhui Nongye Kexue (Journal of Anhui Agri. Sci.), 35(24): 7422-7424 (白玉, 2007, DNA分子标记技术及其应用, 安徽农业科学, 35(24): 7422-7424)

Wang Q.S., and He G.H., 2007, Genetic divergence between rice germplasms of blast resistance and the major WA-CMS type restorers, Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding), 5(1): 74-78 (王秋实, 何光华, 2007, 水稻抗稻瘟病资源与野败型骨干恢复系间的遗传差异, 分子植物育种, 5(1): 74-78)

Duan S.H., Mao J.N., and Zhu Y.G., 2002, Genetic variation of main restorer lines of hybrid rice in china was revealed by mierosatellite markers, Yichuan Xuebao(Acta Genetica Sinica), 29(3):250-254 (段世华, 毛加宁, 朱英国, 2002, 用微卫星DNA标记对我国杂交水稻主要恢复系遗传差异的检测分析, 遗传学报, 29(3): 250-254)

Lv G.L., Lin Z.L., Bai X.G., Ma K.H., Fu J., Liu F.F., Huang X.Q., Gway J.G., and Cheng Z.Q., 2009, Comparative assessment of Ssimple sequence repeat genetic diversity in cultivated rice from Yunnan, Zhiwu Xuebao(Chinese Bulletin of Botan), 44(4):457-463 (吕广磊, 蔺忠龙, 白现广 ,Kyung-Ho Ma, 付坚, 刘芳芳, 黄兴奇, Jae-Gyun Gway, 程在全, 2009, 云南栽培稻种SSR遗传多样性比较, 植物学报, 44(4): 457-463)

Qin X.Y., Wei S.M., Zhu N.C., Tang J.H., Li W.K., and Li K.A., 2006, Development of gall midge resistant breeding lines in rice through gathering hybridization, Xinan Nongye Xuebao(Southwest China Journal of Agricultural Sciences ), 19(6):1054-1057 (秦学毅, 韦素美, 朱汝财, 唐健淮, 李维科, 黎坤爱, 2006, 采用聚合杂交创新稻瘿蚊抗性育种材料, 西南农业学报, 19(6): 1054-1057)

Shi Y.F., Ying J.Z., Wang L., Zhu Z.W., and Zhuang J.Y., 2005, Screening SSR markers for rice variety identification, Zhongguo Shuidao Kexue ((Chinese Journal of Rice Science), 19(3):195-201 (施勇烽, 应杰政, 王磊, 朱智伟, 庄杰云, 2005, 鉴定水稻品种的微卫星标记筛选, 中国水稻科学, 19(3): 195-201)

Xiao X.Y., Wang Y.P., Zhang J.Y., Li S.G., and Rong Y.Z., 2006, SSR marker-based genetic diversity fingerprinting of hybrid rice in Sichuan, China, Zhong guo Shui dao Ke xue ((Chinese Journal of Rice Science), 20(1):1-7 (肖小余, 王玉平, 张建勇, 李仕贵, 荣廷昭, 2006, 四川省主要杂交稻亲本的SSR多态性分析和指纹图谱的构建与应用, 中国水稻科学, 20(1): 1-7)

Zhuang J.Y., Shi Y.F., Ying J.Z., E Z.G., Zeng R.Z., Chen J.,and Zhu Z.W., 2006, Construction and testing of primary microsatellite database of major rice varieties in china, Zhong guo Shui dao Ke xue((Chinese Journal of Rice Science), 20(5): 460-468 (庄杰云, 施勇烽, 应杰政, 鄂志国, 曾瑞珍, 陈洁, 朱智伟, 2006, 中国主栽水稻品种微卫星标记数据库的初步构建, 中国水稻科学, 20(5): 460-468)