研究背景
烟草作为重要的经济作物，其烟叶品质备受关注，而烘烤过程是影响烟叶品质的关键环节。生产实践中，根据烟叶的烘烤特性来制定相应的烘烤工艺。易烤性作为烘烤特性的重要组成部分，体现在烘烤过程中的变黄期中，烟叶的变黄、脱水的难易程度及同步程度(倪超等, 2011)，主要受品种基因型的影响。因此，选育出易烤性好的品种成为保障烤后烟叶品质的重要环节。但是，针对易烤性直接开展鉴定和选择，存在着成本高、耗时长、易受环境影响等困难，因此烤烟品种的易烤性育种和品种改良长期难以取得突破性进展。随着分子标记技术的出现，为人们从分子水平上研究和鉴定烟草性状变异提供了技术基础。利用与烤烟易烤性紧密连锁的分子标记或功能标记，可以在苗期、早代、室内进行有效的选择，从而加速育种过程提高育种效率，还可以避免环境条件的干扰。

目前，烟草分子标记的开发和高密度遗传图谱的构建已经取得很大进展(Lin et al., 2001; Julio et al., 2006; Bindler et al., 2007;Bindler et al., 2011; Julio et al., 2006; 马红勃等, 2008)，而且不同类型的遗传图谱已经成功地应用到某些重要性状的QTL定位研究中(肖炳光等, 2006;肖炳光等, 2007)，其中，谭效磊等（2012)利用易烤性好的烤烟品种云烟85和易烤性差的烤烟品种大白筋599杂交得到的F2群体，借助SSR分子标记技术，构建了一个17个连锁群、75个标记的烤烟遗传连锁图，对烤烟易烤性进行了QTL定位分析，共检测到4个QTL。中国农业科学院烟草研究所还利用相同的群体，在谭晓磊的研究基础上，扩大了样本容量和标记密度，成功定位了一系列与烤烟易烤性相关的QTL位点，具有良好的应用前景(将另文发表)。通常情况下，任何连锁标记在进入应用之前都必须进行适用性验证(Zhang et al., 2003;Romagosa et al., 1999)，但是目前关于烤烟易烤性相关标记的有效性验证还尚未有报道。为此本研究对检测出的5个遗传贡献率较高，较稳定的SSR标记在分离群体和自然群体中开展了有效性和适用性验证研究。

 

1结果与分析
1.1供试群体易烤性表型鉴定
供试F2群体的易烤性变黄指数平均值为55.72%，变异幅度为19.52%~89.52%，其次数分布如(图1)所示，经检验符合正态分布(表1)。供试自然群体的易烤性变黄指数平均值为79.12%，最大值是秦烟96，变黄指数为96.04%，最小值是革新三号，变黄指数为55.95% (图2)。

图1 F2群体变黄指数次数分布 Figure1 Distribution of the number of yellowing index in F2 population

表1 F2群体表型正态分布检验 Table1 Test of normal distribution of phenotype in F2 population

图2 供试自然群体变黄指数分布 Figure 2 Distribution of yellowing index in tested natural population

1.2供试标记的遗传多样性分析
对5个供试SSR标记，在自然群体上的遗传多样性进行了分析(表2)。结果表明：在供试群体中共扩增到12条多态性位点(条带)，PT20391和Sca878均检测到3个多态性位点，其余引物各检测到2个多态性位点。供试群体的总体遗传多样性Nei指数为0.4178，Shannon指数为0.6634。标记PT20391和Sca878的遗传多样性最为丰富。聚类分析结果如图3所示，供试群体在图中虚线所示的位置可分为2个类群，类群I包含了易烤亲本云烟85等12个品种，类群II包含了不易烤亲本大白筋599等12个品种。由(图3)可知，2个类群间存在较大的遗传差异，图中类群II的品种聚类关系非常发散，说明具有较高的遗传多样性；而类群I的品种都聚集在一起，说明该类群的遗传多样性非常低。分别统计2个类群的遗传多样性也说明，类群II的遗传多样性高于类群I。类群II的Nei指数为0.453 2，Shannon指数为0.664 4，类群I的Nei指数为0.017 4，Shannon指数为0.057 4。

表2供试群体内遗传多样性指数 Table 2 Genetic diversity index within tested population

图3 24份供试材料的聚类关系 Figure3 Cluster relation of 24 tested materials

1.3基于分离群体的供试标记选择效率验证
逐一对5个供试SSR标记进行F2分离群体分型，分别去掉杂合个体后，依据亲本云烟85和大白筋599的带型，将供试群体分成两组。计算两组材料的易烤性均值并做方差分析(表3)。除标记PT53143外，其余标记PT51976、Sca878、PT55400、PT20391的两种带型个体间易烤性均值差异均达显著或极显著水平。表明利用后述4个SSR标记对分离群体材料易烤性选择是有效的。

表3 5对SSR引物不同基因型间的变黄指数方差分析 Table3 Variation analysis of yellowing index of marker genotype of five pairs of SSR primers

1.4基于自然群体的供试标记选择效率验证
为了进一步验证5个供试SSR对烤烟品种易烤性评价与鉴定的有效性，本研究又对由24份烤烟品种组成的供试自然群体进行了标记扩增和检测。统计供试品种中来源于云烟85的目标QTL等位位点的数量，分型情况(表4)。结果表明，全部供试材料可分为2组极端类型。一组含有全部目标QTL等位位点(组I, 有效位点数等于5)，包括云烟85等12份品种；另一组不含或含有少量目标QTL等位位点(组II, 有效位点数小于等于2)，包括剩余的12份品种。进而对组I和组II间易烤性差异进行方差分析，结果表明，组I的易烤性好于组II，且差异达到极显著水平(图4; 表5)。此外，该分组方式也与1.2中的聚类结果完全一致。

表4 24份供试品种变黄指数和检测到的QTL数量 Table 4 The number of QTL detected and yellowing index of 24 tested cultivars

图4 两组供试烤烟品种变黄指数的均值比较 Figure4 Comparison of yellowing index mean between the two groups

表5 两组供试烤烟品种变黄指数差异比较 Table5 Variation of yellowing index between the two groups

2讨论
烤烟易烤性连锁标记的获得，可以进行分子标记辅助育种，提高育种效率。在筛选与易烤性相关的标记的同时，需要对已有分子标记的效应进行检验和验证。因为影响分子辅助选择育种的因素较复杂，其主要的原因包括：首先，表型的遗传率影响分子标记的选择效率，过高过低的遗传率都会影响选择效率，应在中度(0.3~0.4)为好(Moreau et al., 1998)。其次，标记与目的基因的连锁的紧密程度会影响分子标记的选择效率，连锁越紧密，选择的可靠性会越高。还有分子标记的数目对标记的选择效率也有影响，利用6个标记时效率最佳，过多的分子标记在低世代时选择效率降低，过少的标记同样也会降低选择效率(Gimelfarb andLande, 1994)。因此，为了将分子标记的鉴定和分子标记辅助选择有效的结合，本研究对5个与易烤性连锁的标记在F2群体和自然群体中进行应用性验证。F2群体验证的结果发现，除标记PT53143外，其余标记PT51976、Sca878、PT55400、PT20391的两种带型个体间易烤性均值差异均达显著或极显著水平，说明分子标记在F2群体上具有一定的选择效率，可以有效地区分易烤性性状不同的单株。在自然群体上，根据含云烟85的目标QTL等位位点的数量多寡将24个品种分为两类，并且两类群体的易烤性均值差异达到极显著水平。进一步证明分子标记在种质资源的筛选是有效的。通过对自然群体的遗传多样性分析和聚类分析还发现，包含易烤亲本云烟85的类群遗传多样性显著低于不易烤亲本的类群，这种结果符合选择牵连效应(Palaisa et al., 2004; Lukens and Doebley, 2001; Andolfatto, 2001)，进而推测在标记的周围很有可能存在与易烤性相关的基因。

本研究所验证的5个分子标记可以应用于对种质资源的筛选与鉴定，根据含有目的基因的数量，可以作为选择易烤性好坏的评价依据。在种质资源的分子鉴定和育种群体的分子筛选时，可以选择含有全部优异等位位点的材料，淘汰不含或含有少量优异等位位点的材料。由于目前所用标记还属于初定位，距离目的基因还有较长距离。接下来还应进行QTL的精细定位研究以及目的基因的分子克隆。从而获得更加有效的连锁标记或功能标记，以提高选择效率和准确性，最终实现个体水平的精确选择。

3材料与方法
3.1供试材料
3.1.1供试分离群体
分离群体以云烟85（易烤性好）和大白筋599（易烤性差）为亲本，构建了F2群体，共含有200个单株，于2014年种植在中国农业科学院烟草研究所青岛即墨试验农场。

3.1.2供试自然群体
根据种质鉴定记录，从中国烟草种质资源中期库中挑选出了24份易烤性较好和较差的品种资源(表6)，于2014年种植在山东诸城试验农场。

表6 24份烟草种质名称和种质类型 Table6 Name and type of 24 germplasms

3.2用于易烤性验证的分子标记
供试分子标记来自中国农业科学院烟草研究所已检测到与易烤性紧密相关的标记(表7)。所用SSR引物包括中国农业科学院烟草研究所自主开发引物和Bindler等(2007, 2011)发布的引物。

表7 用于扩增的5对SSR引物序列信息及其对应的QTL Table7 Sequence and QTL of the 5 pairs of SSR primers used for amplification

3.3易烤性表型鉴定
F2分离群体采用苗期暗箱试验变黄指数作为衡量烟叶易烤性的测定指标(倪超等, 2011)。自然群体采用成熟期烟叶暗箱试验变黄指数作为衡量烟叶易烤性的测定指标，每24 h测定一次变黄比例，累计测9次算出变黄指数，取前4次变黄稳定期数值算出变黄指数（徐秀红等, 2014）。

3.4 DNA提取及SSR分析
DNA提取按照杨本超等(2005)的方法进行提取。PCR反应体系和程序按照谭效磊(2012)的方法进行。

3.5 统计分析方法
使用PopGene3.2软件计算出遗传多样性Nei指数和Shannon指数。聚类分析使用Powermarker软件以NJ法进行。方差分析和正态分布检验使用SPSS19.0软件进行。

 

作者贡献
王春凯是本研究的实验设计和实验研究的执行人；任民协助完成数据分析；徐秀红是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；许家来、王传义、李青山协助和参与实验的过程。全体作者都阅读并同意最终的文本。

 

致谢
本研究由国家烟草专卖局烟草基因组计划重大专项(110201301008[JY-08])；中国烟草总公司科技重点项目(110201002017)和国家公益性行业(农业)科研专项(201203091)共同资助。

 

参考文献
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