植物病原菌无毒基因是一类编码的蛋白能被寄主植物内相应的抗性基因所特异性识别的基因；也是激发子的重要成员；其编码特殊的效应子蛋白及小分子物质(Ellis et al., 2009)。无毒基因与寄主 R 基因之间的直接或间接识别引起抗性反应，即效应子触发性免疫(ETI)，从而引发局部细胞发生过敏性坏死反应(HR反应)(Rouxel and Balesdent, 2010)。这一过程将加剧植物与病原菌间的军备竞赛共进化，即病原菌通过突变或丢失效应子或形成新的能够逃避或抑制ETI的效应子。相对植物而言，则形成新的 R 蛋白以调节新的效应子的识别(De Wit, 2007)。

植物病原真菌，如丝状病原菌，能在自然界和农业植物群落中引发一系列的病害症状(Oliva et al., 2010)。丝状病原菌在寄主植物内寄生，并能引发寄主细胞坏死。病原菌与寄主植物间的互作分为亲和性互作与非亲和性互作(Liu et al., 2010)。根据病原菌的效应子蛋白与寄主植物R 蛋白的非亲和性作用的位置，可将植物病原真菌分为2 种类型：一种是具有吸器的真菌，如大麦白粉菌与亚麻锈菌等；该类病原菌的效应子蛋白可能先在其吸器中表达，然后被病原菌转运到寄主的细胞质中；据推测其相应的R 基因多位于细胞质。另一种是胞外分泌型真菌(extracellular fungi)，如番茄叶霉菌、油菜茎基溃疡病菌、稻瘟病菌及大麦云纹病菌等；该类病原菌的无毒基因被分泌到质外体，其相应的 R 基因多位于细胞质膜上或具有一个跨膜结构域及一个胞间LRR结构(图1) (Hammond-Kosack and Kanyuka, 2007; De Wit et al., 2009)。胞外分泌型病原菌最显著的特征是编码胞外分泌型效应子蛋白。胞外分泌型效应子具有如下特征；第一，该效应子被分泌到寄主植物的质外体或木质部；第二，该效应子蛋白的N-端，有时C-端往往在侵染期间被植物和/或真菌的蛋白酶进一步地加工，形成成熟的蛋白；另外，同其它在寄主细胞内活跃的效应子一样，胞外分泌型效应子的另一个特征是，携有多个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基可能参与维持蛋白结构稳定的分子内二硫键的形成(Stergiopoulos and de Wit, 2009)。

图1 Avr蛋白和R蛋白在不同寄主—病原物互作过程中的位置 Figure 1 The location of Avr proteins and R proteins in different host-pathogen interaction

由植物病原真菌引起的植物病害是农业生产的主要限制因子之一，严重威胁着世界的农作物生产。实践证明，培育和合理利用抗病品种是目前控制此类病害最经济有效和对环境安全的手段。然而，由于频繁出现能克服新导入的R基因的小种，使得培育的抗病品种只具有短期的抗病效应(Zeigler et al., 1994)。随着生物信息学的快速发展以及生物体全基因组测序时代的到来，这必将加速病原菌无毒基因与寄主抗病基因的分离、克隆以及它们之间相互作用分子机制的研究；从而为植物病害的防治提供新的理论与途径。

本文综述了胞外分泌型真菌，包括番茄叶霉菌、油菜茎基溃疡病菌及稻瘟病菌无毒基因研究的最新进展。进一步对植物病原真菌无毒基因的结构、内在(intrinsic)功能与进化机制以及后基因组时代无毒基因克隆策略的变化及其对策进行了探讨。

1已克隆的植物病原真菌无毒基因
1.1叶霉病菌无毒基因
由番茄叶霉菌(Cladosporium fulvurn)侵染而引起的番茄叶霉病是一种真菌性病害，该病害是番茄生产的重要病害之一(叶青静等, 2005)。番茄叶霉菌是一种无性繁殖的胞外真菌性病原菌(Thomma et al., 2005)。迄今，通过反向遗传学(reverse genetics)途径已从番茄中成功分离、克隆了4 个番茄叶霉菌无毒基因，即Avr2、Avr4、Avr4E 和 Avr9；这些无毒基因都编码富半胱氨酸的小分子量的蛋白激发子(Takken et al., 2000) (表1)；能特异性介导番茄中与之互补的Cf 抗性基因的抗性。此外，在番茄叶霉菌繁殖过程中，还分泌4 种细胞外蛋白(ECP1、ECP2、ECP4 和 ECP5)进入质外体空隙；这些蛋白在番茄植株中激发特异的过敏反应(De Kock et al., 2005)。另外，新的细胞外蛋白ECP6 与ECP7 也已被鉴定(Bolton et al., 2008)。

Avr2 编码由78 个氨基酸组成的前体蛋白，该蛋白经真菌蛋白酶类与植物蛋白酶类加工后形成包含8 个半胱氨酸残基的成熟蛋白，它们能够诱导携带抗性基因Cf-2的番茄品种产生过敏性坏死反应(HR反应) (Dixon et al., 1996; Luderer et al., 2002b)。Takken 等(2000)基于大多数无毒蛋白在携有相应抗病蛋白的寄主植物中产生HR的思路；采用功能性克隆法分离了无毒基因 Avr2。通过构建病原菌的cDNA文库，将cDNA组装到 PVX (potato virusX)双元表达载体上，并将重组的 PVX 载体接种到番茄中，PVX介导的无毒基因与含相应抗性基因的植物互作，在接种部位产生HR反应，从而被诱导出来；继而可以获得相应无毒基因的克隆。在侵染期间，Avr2 至少抑制4 种与寄主植物防御相关的半胱氨酸蛋白酶的表达(Kruger et al., 2002; Rooney et al., 2005; Shabab et al., 2008)。在抗性蛋白Cf-2存在的条件下，无毒蛋白Avr2行使无毒因子的功能，且番茄叶霉菌抗性基因Cf-2介导的抗性受Rcr3基因的调控。Avr2 基因的点突变、删除或转座子插入都能促使AVR2蛋白无毒性功能的丧失(Luderer et al., 2002b)。近期的研究表明；番茄叶霉菌菌株的 Avr2 等位基因间存在过多的非同义替换，显示了强烈正向选择迹象。这主要是由于该基因的编码区域被插入或删除了部分碱基，形成了截短的Avr2蛋白，从而引起功能的改变(Stergiopoulos et al., 2007)。

基因的分离、克隆可通过2 种不同的克隆途径来实现，即反向遗传学途径和正向遗传学(forward genetics)途径(Takahashi et al., 1994)。在反向遗传学研究中，基因所影响的表型并不清楚，但可以通过遗传转化来研究该基因的功能以及所引起的表型变异。无毒基因Avr4、Avr4E 和Avr9 都是利用反向遗传学的方法克隆得到。

Avr4 编码135 个氨基酸的蛋白前体，该蛋白前体分泌在番茄的质外体空隙中。其C-和N-末端经蛋白酶类加工后形成成熟的蛋白(Joosten et al., 1997)；其中包含8 个对 Avr4 蛋白的构象与毒性至关重要的半胱氨酸残基。并且，Avr4 蛋白二硫化物结合区域的结构与无脊椎动物几丁质结合区域同源(van den Burg et al., 2003)。van den Burg等(2006)将Avr4蛋白结合到几丁质上，结果发现在病原菌侵染植物期间，Avr4 蛋白能够保护叶霉菌的几丁质。van Esse等(2007)将叶霉菌暴露在几丁质酶中，或沉默番茄叶霉菌的Avr4 基因时，发现该真菌对几丁质酶的抑制显著降低，这进一步地证实了Avr4 基因只有在病原菌侵染寄主期间才表达。并且，番茄叶霉菌Avr4 基因最自然的变异是该基因编码区发生的单个点突变，从而引起半胱氨酸残基的替换，一方面可以逃避抗性基因Cf-4 的识别，另一方面却保留了几丁质结合活性(van den Burg et al., 2003)。

Avr4E 编码富含半胱氨酸的101 个氨基酸的蛋白，该蛋白在叶霉菌侵染植物期间，分泌到质外体中并触发Cf-4E介导的HR反应(Westerink et al., 2004)。很多叶霉菌菌株已经被证明能够逃避Cf-4E介导的抗性，这些菌株的Avr4E基因的编码区都显示2 个一致的点突变，该突变的Avr4E基因形成稳定的具有2 个氨基酸置换的Avr4E蛋白，即Phe⁶² Leu 与 Met⁷³ Thr(AVR4E^LT)的变化。Westerink等(2004)研究表明，Avr4E蛋白第62 位的单个氨基酸的非同义替换能够调控Avr4E与其相应抗性基因的识别。目前，Avr4E基因及其编码产物的特征还有待进一步研究。

Avr9 编码63 个氨基酸的前体蛋白，经蛋白酶类加工后形成包含6 个半胱氨酸的成熟蛋白(Westerink et al., 2004)。前人的研究表明，这些半胱氨酸残基是维持Avr9 的结构稳定及诱导植物细胞的HR反应所必不可少的(Stergiopoulos and de Wit, 2009)。Avr9 能够诱导带抗性基因Cf-9 的番茄品种产生抗性。Marmeiss等(1993)基于同源重组的策略，将番茄叶霉菌的Avr9 基因敲除，结果并不影响该病原菌在感病番茄植株上的体外生长或毒性，该研究表明Avr9 基因并不是番茄叶霉菌全毒力所必需的。事实上，所有能够逃避Cf-9 抗性基因识别的叶霉菌都是自然缺失Avr9 基因的菌株(Stergiopoulos et al., 2007)。有趣地，当在体外限制氮元素的条件下，Avr9 的表达被诱导，表明其蛋白产物与病原菌的氮代谢途径有关(Thomma et al., 2006)。

编码胞外蛋白的6 个基因Ecpl、Ecp2、Ecp4、Ecp5、Ecp6 与 Ecp7 已被克隆。Luderer等(2002)的研究表明，所有的番茄叶霉菌在侵染植物期间都大量分泌Ecps蛋白，这些蛋白都是富含偶数半胱氨酸残基的蛋白。其中Ecpl 和 Ecp2 基因基于反向遗传学法被克隆。当番茄叶霉菌无毒基因Avr4 和Avr9 在寄主植物内被诱导时，植物体内的 Ecpl和Ecp2 也被强烈地诱导，表明 Ecp 与 Avr 共同激活植物抗病相关途径(Stergiopoulos and de Wit, 2009)，即Avr与Ecp 在番茄抗叶霉菌过程中起着至关重要的作用。尽管绝大多数的Cf-Ecps基因已经被遗传定位，但已被克隆的番茄叶霉菌抗性基因却很少(Soumpourou et al., 2007)。

阐述已特征化的番茄叶霉菌无毒基因，有助于了解叶霉菌与番茄植株之间的相互识别机制，为克隆更多的叶霉菌无毒基因提供了新的思路与途径，并对番茄广谱抗病基因的鉴定及挖掘具有重要的指导意义。

1.2油菜茎基溃疡病菌无毒基因
在最近的40 年期间，油菜黑胫病是油菜生产上最严重的病害之一(Rouxel and Balesdent, 2005)。其病原菌为小球腔菌属Leptosphaeria的复合种，至少包括两个小种：油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)和油菜黑胫病菌(L.biglobosa)。油菜茎基溃疡病菌致病力强，能引起油菜及其他十字花科植物茎基溃疡病的发生，是油菜产量损失的主要因素(Fitt et al., 2006)，其引起的产量损失严重时可达30%-50%。目前，只有3 个油菜茎基溃疡病菌无毒基因被克隆；这3 个无毒基因是 AvrLm1, AvrLm6 与 AvrLm4-7都是通过图位克隆的策略得到的(Gout et al., 2006 ; Fudal et al., 2007; Parlange et al., 2009) (表1)。

表1 目前已知克隆的胞外分泌型真菌无毒基因 Table1 Extracellular fungi avirulence genes known to-date

AvrLm1被定位在269 kb富含AT的区域，该区域是类异染色质区域由4 个长末端重复(LTR)逆转录转座子组成，包含极少的基因(Gout et al., 2006 )。AvrLm6 也被定位在133 kb的非编码区域，且该区域也主要包含LTR逆转录转座子(Fudal et al., 2007)。与到目前为止已克隆的真菌无毒基因相反，无毒基因AvrLm1 与AvrLm6 的GC含量都较低。且这2 个无毒基因都是单拷贝的，分别编码205 个与144 个氨基酸的小的分泌蛋白，并且这些蛋白既与已报道的蛋白不具有同源性，也不具有推定的与内在功能相关的特征化结构。迄今，尽管AvrLm1与AvrLm6 的无毒性功能已确定，但其相应的抗性基因Rlm1与Rlm6 尚未被克隆(Ricardo et al., 2010)。因此，这2 组蛋白的识别及互作机制尚未清楚。另一方面，AvrLm6 蛋白含有6 个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸通过形成分子内二硫间以维持AvrLm6 蛋白在植物质外体中的稳定性。相反，AvrLm1 蛋白只包含一个半胱氨酸残基，鉴于所有已报道的质外体效应子都是富含半胱氨酸的蛋白(Kamoun, 2007)，因此AvrLm1 蛋白很可能是被转运到寄主细胞内。

AvrLm4-7被定位在238 kb的遗传区域，该区域富含AT，由多重的LTR逆转录转座子组成(Parlange et al., 2009)；该无毒基因对相应的抗病基因Rlm7与Rlm4 都具有无毒性功能。AvrLm4-7 编码143 个氨基酸的推定的分泌蛋白前体，该蛋白前体被蛋白酶类加工后形成包含8 个半胱氨酸残基的成熟蛋白，该成熟蛋白与已报道的蛋白没有同源性。AvrLm4-7 基因的表达在侵入寄主叶片的初期被上调，在接种7 d后，其表达量最高。AvrLm4-7 基因的缺失及部分截短实验表明，保持AvrLm4-7基因的完整性对其无毒性功能至关重要。

综上所述，AvrLm 基因大多位于染色体的亚端粒等非特定的染色体区域，这有利于无毒基因AvrLm 的快速演化以及加速病原菌对寄主的适应性，这也是该类基因具有遗传不稳定性的主要原因(Haas et al., 2009)。同时，上述结果也证明油菜茎基溃疡病菌异常的基因组结构是导致其效应子蛋白结构多样化及快速进化的主要原因(Rouxel et al., 2011)。

1.3稻瘟病菌无毒基因
水稻(Oryza sativa)是全世界最重要的粮食作物之一，全球大约一半以上的人口以稻米作为主食。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是世界水稻生产的主要限制因子之一，严重威胁着世界的粮食安全(Couch and Kohn, 2002)。实践证明，合理利用和培育抗病品种是控制此病害最经济有效和对环境安全的手段(Rouxel and Balesdent, 2010)。稻瘟病菌(Dean et al., 2005)与水稻(International Rice Genome Sequencing Project, 2005) 基因组测序的完成加速了病原菌无毒基因与寄主抗病基因的分离、克隆以及它们之间相互作用等方面的分子机制研究(杨勤忠等, 2009)。从而，为培育具有持久抗瘟性品种及不同抗病品种的合理布局提供了理论基础。

尽管到目前为止，大约已经有40 个稻瘟病菌无毒基因完成了染色体的初步定位，但已被克隆的无毒基因却只有9 个(Liu et al., 2010)。其中，PWL1 和PWL2 都是来源于弯叶画眉草，具有很强的寄主专化性(Kang et al., 1995; Sweigard et al., 1995)；而另外7 个无毒基因AVR1-CO39 (Farman and Leong, 1998)、AVRPita (Orbach et al., 2000)、ACE1 (Böhnert et al., 2004)、AvrPiz-t (Li et al., 2009)、AVRPia、AvrPii和AvrPik/km/kp均来源于水稻(Yoshida et al., 2009) (表1)。

无毒基因 AVR-Pita最初分离自日本菌株O-137，其在水稻细胞内直接表达时触发了Pita介导的抗性。该基因编码中性金属蛋白酶，全长223 个氨基酸，N端具有分泌信号肽及前蛋白序列(Orbach et al., 2000)。Jia等(2000)酵母双杂交实验结果表明，除去前体蛋白及信号肽的AVR-Pita截短蛋白AVR-Pita176能与抗性基因Pi-ta的富亮氨酸结构域(LRD区域)特异性地互作，该蛋白可以诱导Pi-ta依赖的免疫反应。

AVR1-CO39最先被定位在稻瘟病菌第1染色体上610 kb的染色体区域，对水稻品种CO39具有无毒性。前人在分析CO39致病性菌株AVR1-CO39基因座的结构时发现，在稻瘟病菌进化的早期，该基因座就已经发生了遗传重排，导致绝大部分菌株对CO39有毒(张哲等, 2011; Tosa et al., 2005)。然而，迄今为止，AVR1-CO39基因功能的详细特征仍然未知(De Wit et al., 2009)。

ACE1是利用稻瘟病菌田间菌株Guy11与实验室菌株ML25杂交群体定位的无毒基因，可以特异性地诱发携有抗性基因Pi33的水稻品种Irat7的过敏性反应(Böhnert et al., 2004)。ACE1编码的蛋白非常大，编码4035 个氨基酸，该编码产物是聚酮化合物与非核糖体多肽合成酶的复合体。ACE1-GFP融合蛋白研究及亚细胞定位的结果均显示，ACE1能在附着胞中特异性表达，且只在稻瘟病菌侵染水稻期间才表达；该数据也表明无毒基因ACE1与病原菌侵染特性及寄主防御反应相关。

Li等(2009)通过图位克隆的策略从稻瘟病菌无毒菌株81278 ZB 15 (MAT-1) 分离到了无毒基因AvrPiz-t；其在水稻细胞内直接表达时触发了Piz-t介导的抗性。通过序列比对发现菌株81278 ZB 15与菌株Guy11中的AvrPiz-t基因的编码区不存在差异；而GUY11中AvrPiz-t启动子区域存在一个Pot3转座子的插入导致了目标序列(5’TA 3’)的复制。该转座子长度为1 861 bp，含有2个倒置末端重复序列(ITR)和1个ORF，其序列与AvrPita位点的Pot3转座子99%相似。除去Pot3和目标序列后，GUY11中AvrPiz-t的启动子序列与81278 ZB 15相同。农杆菌介导的烟草瞬时表达实验表明，AvrPiz-t基因能够抑制本生烟叶片中促凋亡蛋白BAX诱导的细胞程序性死亡(PCD)，这表明AvrPiz-t是稻瘟病菌致病性所必需的。

Yoshida等(2009)通过基因组关联分析及基因组重测序技术从稻瘟病菌中鉴定到了3 个新的无毒基因AvrPia、AvrPii、AvrPik/km/kp，它们分别编码长度为85、70和113个氨基酸长度的蛋白，且这些蛋白的N末端都是分泌蛋白区域。作者通过这3 个Avr基因在水稻原生质体中的瞬时表达实验，证明了AvrPia、AvrPii、AvrPik/km/kp均能引发含有相对应R基因水稻原生质体细胞的死亡，且均不能引发含非对应R基因水稻原生质体细胞的死亡。然而，至于这些无毒基因在稻瘟病菌生长发育方面具有什么样的功能，还有待于进一步地研究。

近年来，在稻瘟病菌无毒基因的克隆方面虽已取得了一定的进步，但成对克隆的无毒基因与相应抗性基因仅限于AVR-Pita 与Pi-ta、AvrPiz-t 与 Piz-t 及AvrPik|km|kp 与Pikm，无毒基因与对应抗性基因之间互作的情况仍然鲜有报道。因此，关于已克隆的无毒基因与其相应抗性基因的互作机制的阐明还有待更进一步的研究。同时，对稻瘟病菌与水稻互作分子机制的研究如何应用于小种动态变化监测、稻瘟病菌群体组成分析、品种合理布局及延长抗性品种使用年限等(张哲等, 2011)，还有待更深入地探讨与发掘。

1.4 其它胞外分泌型真菌无毒基因
目前已克隆的胞外分泌型真菌无毒基因还有大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)无毒基因Nip1，番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)无毒基因Avr1、Six2、Six3与Avr3。其中Nip1编码一个低分子量的多肽，可以高度特异性地诱导大麦等多种禾本科作物发生坏死反应(Rohe et al., 1995)。Avr1编码小的富半胱氨酸的蛋白(Rep et al., 2005)，被分泌到植物的木质部；Avr3是番茄枯萎病菌对番茄植株全毒力所必需的，编码小的富半胱氨酸的蛋白，在相应的R基因存在的条件下，显示无毒因子的功能触发植株的过敏性坏死反应(Rep et al., 2004)。然而，已克隆的番茄枯萎病菌无毒基因的功能及其同源性尚未清楚；因此，需要更进一步的研究来描述该类无毒基因的结构特征及其功能，以更好地指导经济作物的安全生产。

2 植物与病原菌进化互作机制
近百万年以来，植物与相关的病原菌一直协同进化，自然选择促使病原菌激发及克服植物的防御反应(Rouxel and Balesdent, 2010) 。因此，寄主与病原菌经历着对抗性的共进化，基于多样性选择的方式，促使两者互作过程中蛋白质的多样性。病原菌基因组中存在2 种类型的无毒基因：一种无毒基因具有品种特异性，含有与致病相关的高度保守的蛋白；其中包括番茄叶霉菌的胞外蛋白ECP或Avr4；另一种无毒基因在寄主植物的选择压下遗传变异快，具有高度不稳定性，能快速地逃避相应R基因的识别。然而，目前已知的无毒基因绝大多数都是品种特异性的，具有保守性。

植物与病原菌之间的特异互作遵循经典的“基因对基因”说学(Flor, 1971)，只有当病原菌的无毒基因与其相应的抗病基因相遇时才快速触发局部防卫反应，进而抑制病原菌在侵染位点处的扩散并引发系统抗性(Dangl and Jones, 2001) 。培育与种植抗病品种被认为是控制该病最经济、最有效的方法。然而，由于频繁出现能够克服抗病基因的新的小种，使得获得的抗病品种只具有短期效应。对抗病基因选择压的适应性暗示着无毒基因将会更快速地演变以适应 R 基因的进化。植物抗病基因特异识别的压力促进了相应无毒基因通过等位基因间非同义突变的演化，在此演化过程中，无毒基因的适合度代价是通过其无毒功能的丧失，以逃避相应抗病基因的识别(Yoshida et al., 2009) 。

研究表明，无毒基因可能由于全基因的缺失、移码框突变、非同义点突变、转座子插入等途径，使得病原菌能够逃避寄主植物的识别而克服抗性(Fudal et al., 2009)。事实上，尽管无毒基因在病原菌的适应性上具有至关重要的作用，但抗病基因选择压下无毒基因的进化，也被推定为影响着R-Avr最佳的互作模式(直接或间接互作) (Rouxel and Balesdent, 2010)。

3 问题与展望
尽管科研工作者已对植物病害及防控策略进行了很精细的研究，但全球的农作物安全仍然经受着多种病原菌及害虫的危害(Xu et al., 2008)。植物病害的发生严重威胁着世界尤其是发展中国家的粮食安全。近年来，真菌病原菌比较基因组学的发展，极大地推进着新的效应子蛋白的鉴定以及这些蛋白毒性功能的预测(Westerink et al., 2004)。然而，尚未从目前已经分离与鉴定的无毒基因间发现保守性很高或共有的同源序列；该策略进一步应用具有一定的局限。况且，很多真菌无毒基因的内在功能尚不清楚，且效应子蛋白进入寄主细胞的转运模式仍然有待阐明。因此，在无毒基因与抗性基因的分子克隆的基础上，加强无毒基因与抗性基因互作机制的研究，将更有利于深入了解植物-病原菌协同进化的分子基础、系统剖析植物抗病途径，这为开展新的植物病害防治策略提供理论依据。

作者贡献
第一作者汪文娟负责文献的查阅、分析、比较和总结，并负责论文的写作；汪聪颖、苏菁在论文的修改过程中起到重大作用；陈深参与了论文的校对和定稿。本文通讯作者为朱小源。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31101403)、公益性行业科研专项(201203014)、现代农业产业技术体系建设专项(CARS-01-24，粤财教[2009]356 号)；广东省农业攻关项目(2009B020310010)、广东省农业科学院院长基金等资助。

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