中国是一个水资源非常短缺的国家，干旱是影响水稻产量的主要障碍因素之一(邱福林和张伟平, 2000, 垦殖与稻作, 2: 7-8, 13)。其主要表现表现为抽穗敏感期水分亏缺对产量影响最大(马塞尔和斯特普尔斯, 1985)。邵玺文等(2004)研究表明，水稻抽穗期水分胁迫处理后，其生理指标游离脯氨酸、叶绿素含量等变化最为明显。转录因子CBF(CRT/DRE-binding factor) 是植物抗逆过程中一个重要的调节因子，其广泛存在于拟南芥 、欧洲油菜、水稻、玉米、小麦等各类植物中，能通过识别COR基因中的CRT/DRE(C-repeat/dehydration-responsive element)元件启动COR基因转录(李科友和朱海兰, 2011)。韩国科学家Oh等(2005)将拟南芥CBF3基因转入粳稻品种Nakdong(转基因5 NT)中，并获得含CBF3基因的转基因3材料，进而对含CBF3的转基因3材料和对照转基因5 NT的苗期(生长4周)进行干旱胁迫处理，结果表明CBF3基因能显著提高水稻耐旱性。然而，上述研究并未就干旱胁迫下CBF3基因对水稻脯氨酸、叶绿素等生理生化指标变化影响展开深入研究。

张瑛等(2012)将CBF3基因转入籼稻恢复系，并对干旱条件下CBF3基因对水稻亲本恢复系农艺性状的影响进行研究，发现含CBF3基因的OP193恢复系材料在有效穗、千粒重、单株谷重等方面则表现有较好的配合力。本研究利用转基因5 NT和含CBF3基因的转基因3及含CBF3基因的恢复系材料OP193，研究干旱胁迫条件下CBF3转录因子对水稻抽穗期的生理生化指标脯氨酸、叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白变化的影响，试图进一步揭示转录因子CBF3的在水稻抗旱机制中的作用。

1结果与分析
1.1对照组和处理组抽穗期干旱胁迫下的土壤水分变化
对照组和处理组抽穗期的土壤含水量测定结果如图1。

图1 干旱胁迫处理组和对照组水稻土壤水分变化 Figure 1 Variation of rice soil moisture between the treatment and control

从图1中可以看出，对照组和处理组的土壤含水量均随处理时间呈下降趋势，其中对照组含水量从20%下降到16%左右(可能是抽穗期水稻对水的需求量增大的缘故)，干旱处理的水分从15%下降6%。幅度明显高于对照组，因此，适于做耐旱试验。

1.2抽穗期干旱胁迫下的含和不含CBF3水稻的脯氨酸变化
抽穗期干旱胁迫下，定期取样测定对照组和处理组含和不含CBF3水稻的脯氨酸含量，其变化如图2、图3所示。

图2 未经干旱处理的对照组脯氨酸变化 Figure2 Variation of proline content of the control without drought treatment

图3 干旱处理组的试验材料处理组脯氨酸变化 Figure 3 Variation of proline content of treatment groups

从图2可以看出，对照组呈上升趋势，第6次样品比第1次样品脯氨酸含量增加比例，OP193、转基因3、转基因5分别为225.5%、276.6%、391.6%。如图3所示，干旱胁迫处理组，转基因5 NT材料，第6次样品比处理前增加108.0%，其幅度略小于对照组，而含CBF3的转基因3和OP193，第2次、3次和4次之间有个小幅增加再回落，第5次、第6次开始急剧上升，达到最高的20µg/g左右，分别比处理前增加1 689.4%和1 875.7%，与对照组和处理组转基因5相比，差异十分明显。结果表明，在抽穗期干旱胁迫处理下，CBF3转录因子的表达与脯氨酸含量的急剧增加关联，这可能与水稻的耐旱性相关。

1.3抽穗期干旱胁迫下的含和不含CBF3水稻的叶绿素含量变化
抽穗期干旱胁迫下，定期取样分别测定叶绿素a和b的含量，经1.2.3公式计算得对照组和处理组含和不含CBF3水稻的叶绿素含量及叶绿素a/b比值变化如图4、图5a、图5b所示。
 

图4 对照组和处理组叶绿素含量的变化 Figure 4 variation of Chlorophyll content of the treatment and the control

从图4可以看出，对照组，叶绿素含量变化呈下降趋势，转基因3、OP193、转基因5 NT分别比试验前下降5.3%、7.8%、10.2%，材料间差异也不明显；干旱处理组，总体呈下降趋势，叶绿素含量普遍低于对照组，转基因3和OP193的叶绿素含量分别比处理前下降28.8%和27.2%，而不含CBF3的转基因5材料的叶绿素含量比处理前下降83.1%，与对照组及干旱处理组转基因3和OP193相比，下降幅度差异极大。显然，干旱胁迫导致叶绿素含量的明显减低，而CBF3转录因子的存在则能明显延缓因干旱处理引起的叶绿素含量的下降幅度。

图5a、图5b 对照组和处理组叶绿素a/b比值的变化 Figure 5a 、Figure 5b Variation of Chla/Chlb value of the treatment and the control

另外，如图5a、图5b所示，对照组的转基因3呈先上升再下降的趋势，最高点第4次样品比试验前增加23.2%，OP193、转基因5呈下降趋势，第6次分别比试验前减少4.91%和4.87%，干旱处理组的转基因3和OP193变化也呈下降趋势，第6次分别比试验前减少7.75%和8.56%；而干旱处理组转基因5，叶绿素a/b比值在第3次和第4次开始有明显增加，而第5次则大幅度跃升至最高值99.79，比处理前增加1 437.7%，第6次又降为73.9，但仍比处理前增加1038.2%。因此，与对照组及干旱处理组转基因3和OP193相比，差异十分明显。图5b为图5a的对照组及干旱处理组转基因3和OP193材料的放大部分，可以更好地看出上述变化规律。另外，从叶绿素a/b比值总量上看，对照组在4.5-5.5之间，而干旱处理组转基因3和OP193在6.0-7.0之间，也明显高于相应的对照组。该结果显示：干旱能引起叶绿素a/b比值变化，而CBF3转录因子的存在能明显减缓因干旱导致的叶绿素a/b比值的增加幅度。

1.4抽穗期干旱胁迫下的含和不含CBF3水稻的可溶性糖含量变化
抽穗期干旱胁迫下，对照组和处理组含和不含CBF3水稻的可溶性糖含量变化如图6、图7所示。

图6 对照组试验材料可溶性糖含量变化 Figure 6 Variation of content of soluble sugar of the treatment

 

图7 处理组试验材料可溶性糖含量变化 Figure 7 Variation of content of soluble sugar of the treatment

从图6、图7可以看出，对照组和处理组对应材料间可溶性糖含量大小没有明显差异，其变化趋势也基本相同，都是先上升再下降，再小幅提高，并在第4次取样时有一个峰值。但不同材料间则存在差异，对照组：转基因5 NT的峰值＞含CBF3的OP193＞转基因3，干旱处理组：转基因5 NT的峰值＞含CBF3的OP193和转基因3，而OP193和转基因3则几乎相同。由此表明：抽穗期干旱胁迫时水稻可溶性糖含量的变化与CBF3基因的存在无关联。

1.5抽穗期干旱胁迫下的含和不含CBF3水稻的可溶性蛋白含量变化
抽穗期干旱胁迫下，对照组和处理组含和不含CBF3水稻的可溶性蛋白含量变化如图8、图9所示。

图8 处理组可溶性蛋白含量变化 Figure8 variation of content of soluble protein of the treatment

 

图9 对照组可溶性蛋白含量变化 Figure 9 variation of content of soluble protein of the control

从图8、图9可以看出，对照组：3个材料可溶性蛋白含量变化存在先下降，再上升再下降的波浪形下降趋势，而干旱处理组对应材料间可溶性蛋白含量的波浪形下降趋势更明显。不同材料间也存在差异，对照组：转基因5的变化幅度＜含CBF3的OP193＜转基因3，干旱处理组：转基因5的变化幅度＜含CBF3的OP193和转基因3，而OP193和转基因3则几乎相同。结果表明：抽穗期干旱胁迫时，CBF3基因的存在对水稻可溶性蛋白含量的变化影响不大。

2讨论
渗透调节是植物防御干旱的一种重要方式，渗透调节的生理效应是增加细胞溶质浓度，降低渗透势，保持膨压，缓解脱水胁迫伤害，有利于保持水分和细胞各生理过程的正常进行(白向历, 2007)。脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白作为植物主要的渗透调节物质之一，近年来被广泛研究（黄文江等, 2002）。叶绿素是植物最重要的收集转换光能的光受体色素, 叶片失绿被认为是叶片衰老的最主要和最初的症状(孙耀中和东方阳, 2008)。在干旱胁迫下，叶片叶绿素含量越高、Chla/Chlb值越低，品种越抗旱(方子云, 2004, 长江科学院院报, 21(4): 1-3; 张燕之等, 2002)。因此, 叶绿素含量的变化可作为衡量水稻抗旱性强弱的重要指标(孙耀中和东方阳, 2008)。

转录因子CBF是一个的小基因家族(Gilmour et al., 1998)。其N 端含核定位信号区, C 端含酸性激活区, 中间含与DNA 结合的AP2结构域(Haake et al., 2002)。CBF 基因可分为两类，一类是依赖于ABA，如CBF4；另一类是不依赖于ABA，如CBF1、CBF2、CBF3、CBF5、CBF6(Sakuma et al., 2002)。CBF 基因易受到低温、干旱、高盐等逆境的非生物胁迫因子诱导表达(Haake et al., 2002)。在逆境胁迫下, CBF 转录因子能够识别含有核心序列CCGAC CRT/ DRE元件的启动子, 与之特异相结合, 从而激活该启动子下游基因的表达以抵御不良环境(Baker et al., 1994)。目前，已从各类植物中克隆出能调控干旱、高盐及低温等逆境条件的DREB/CBF基因，并得到对应的转基因植株(李科友和朱海兰, 2011)，为植物抗逆育种提供了一条新途径。

本研究的结果表明，干旱胁迫条件下，CBF3转录因子的表达可能参与了脯氨酸、叶绿素合成途径的调控，从而促进了脯氨酸含量的大幅增加，同时延迟了叶绿素含量的下降幅度，这可能与水稻的耐旱性机制十分相关。

3材料与方法
3.1试验材料
含转录因子CBF3的转基因3材料和不含CBF3的转基因5 NT材料(为转基因3的野生型)来源于韩国明知大学生物科学与生物信息学系。含CBF3的OP193由安徽省农科院水稻研究所提供。

3.2干旱处理试验条件设计
试验于2011年7月至11月在安徽省水稻遗传育种重点实验室完成。采用人工盆栽控制水分的方法，栽苗用底部带孔的圆形盆钵，其直径20cm,上部直径31cm, 盆深33cm, 盆钵则放在宽40cm、长60cm、高30cm的长方形塑料盆中，在每个圆盆钵底部放上2层滤纸，再装入吸水性较好的经过清洗、烘干处理并先后过直径4cm和1.5cm×20cm筛的细沙土15 kg。试验使用全营养液参照菲律宾国际水稻所配方(程维民等, 2011)。

试验分对照组和处理组，设四个重复,7月1日滤纸催芽，待苗长至0.5寸左右进行移栽至圆盆钵中，平均每3天1次将全营养液放入长方形塑料盆中，以确保水稻正常生长。在干旱试验处理开始时，对照组则改营养液为加去离子水，使其正常生长，具体抽穗时间：转基因3为10月18日，转基因5为10月24日，OP193为10月27日。干旱处理组则停止加入营养液和去离子水，处理时间15天，自10月15日至10月31日(必要时，用喷洒少许去离子水以防止其枯死)。每隔3天，定期取叶片样品测定生理生化指标，并同时测定其沙土水分含量。

3.3沙土水分含量测定
上午九点半点取样，取盆内沙表面以下5cm处样，共取5个散点，散点均匀分布，取好的沙置于小烧杯内，并精确快速称取10.0g，在80C°烘至恒温称重，计算相对含水量。计算公式如下：
相对含水量(%)=(湿沙土重量-干沙土重量)*100/干沙土重量

3.4脯氨酸、叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白测定方法
脯氨酸、叶绿素含量测定参照(赵海泉, 2008, 基础生物学实验指导/植物生理学分册, 中国农业大学出版社, pp.21-25, 83-84）。可溶性糖测定参照(张宪政等, 1994, 植物生理学实验技术, 辽宁科学技术出版社, pp.144-145)；可溶性蛋白测定参照文献(应奇才, 2004)。试验测定设3次重复，平均误差不大于1%。

3.5 叶绿素含量和叶绿素a/b比值的计算
叶绿素含量=叶绿素a+叶绿素b；叶绿素a/b比值=叶绿素a/叶绿素b。

作者贡献
张瑛和周俊峰是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张瑛、周俊峰完成数据分析，论文初稿的写作；施伏芝、阮新民、滕  斌、吴敬德参与实验设计，试验结果分析；张瑛和罗志祥是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由科技部国际合作项目(2010DFA31950)，国家863项目(2012AA101103)，973计划前期研究专项(2011CB111506)，安徽省自然科学基金项目(11040606M97)共同资助。

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