膜结合型粘蛋白(membrane-bound mucin, MUC)位于上皮细胞膜内，具有氨基端细胞外结构域、跨膜结构域和羧基端细胞内胞浆尾的典型结构(Senapati et al., 2010)。近年来它在细胞-基质作用、细胞信号转导(Kufe, 2009)、真核细胞渗透压感知和癌细胞生物性能调控等方面有了更新的认识(Turner, 2009)。研究发现膜结合型粘蛋白在呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道(Singh et al., 2006)和肝胆管等的癌组织中过度表达，这提示膜结合型粘蛋白可能是肿瘤发生、转移和癌细胞抵抗化疗药物的特殊标记物。应用膜结合型粘蛋白启动子特点抑制其表达，正在研究于基因治疗。从而研究粘蛋白基因调控，可以在控制肿瘤向腺癌转变的过程和预后中作为可能的治疗工具和评估标记物。迄今研究发现的膜结合型粘蛋白包括MUC1、MUC3、MUC4、MUC11、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17和MUC20，其中MUC1、MUC3和MUC4在多种组织粘膜腔道中广泛分布，被认为与多组织的肿瘤发生有关。调控粘蛋白基因表达的分子机制正在深入研究中，然而迄今关于MUC11、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17和MUC20的转录调控信息知之甚少。本文主要以研究较热的MUC1、MUC3和MUC4为代表探讨膜结合型粘蛋白在基因启动子水平的转录调控，并总结了基因基本启动子分析研究的一般方法，以期为膜结合型粘蛋白在基因启动子的进一步研究提供理论参考。

1膜结合型粘蛋白MUC1的转录调控
MUC1基因位于1q21，其转录调控已在乳腺癌细胞被广泛研究， MUC1在乳腺组织中过表达通常是作为肿瘤或癌症发展的标志物。MUC1基因典型的TATA盒子位于-28/-24，同时其基因启动子富含GC盒、CAAT盒等顺式作用元件(Desseyn et al., 2008)。5’侧翼2.9 kb核苷酸序列已在NCBI中公开，包括多个特异的转录因子结合位点：Sp1、AP-1、AP-2、AP-3、NF-1、ER、STAT转录因子。在乳腺癌细胞株MCF-7中，发现一个45 KD的蛋白与其启动子区域-505/-485特异结合，在MUC1转录过程中发挥必不可少的作用(Gaemers et al., 2001)。MUC1启动子中有3个富含嘌呤的区域，分别是M-PMR1 (-641/-615)、M-PMR2 (-253/-237)和M-PMR3 (-133/-102)，这种一条链富含GA另一条链富含CT的镜面重复元件，与H-DNA双螺旋结构有关，一个27 KD的蛋白与H-DNA双螺旋作用参与转录调控(Vincent and Van Seuningen, 2008)。M-PMR3元件可轻度抑制MUC1的转录活性，它影响SpA的结合特异性。在-2753/+263有184 CpG位点，对MUC1启动子区进行DNA甲基化和H3-K9修饰可调控MUC1表达上调(Yamada et al., 2008)。

 应用荧光素酶报告基因系统在多种表达MUC1的人上皮细胞株中发现，MUC1基因启动子-743/-1区域有最大转录活性，它也是具备启动子活性的最短片段。其中-150/-60区域是MUC1组织特异性表达的核心启动子序列，包含了一个Sp1 (-99/-90)和一个E-MUC1 (-86/-64)的转录因子结合位点(Koga et al., 2007)。-598/-485区域是人乳腺癌细胞株MCF-7表达MUC1的重要启动子序列。-101/-89区域是反式作用元件Sp1和SpA的共同结合位点，SpA在乳腺癌细胞中是MUC1的转录抑制因子，识别基序为AGGGGGCGGGG，而Sp1的识别基序为GGGCGG。MUC1的表达增加会导致Sp1随之增加，所以Sp1与SpA的比例在MUC1转录调控中起到重要作用(Kuwahara et al., 2005)。

MUC1启动子区包含IFN-γ、细胞因子等多个信号通路因子的顺式作用元件。4个转录STAT位点(-90、-75、-55、-35)在TATA盒子和GC盒子附近，它们是干扰素信号通路的下游作用元件。促炎症因子IFN-γ、IL-6可分别活化STAT1、STAT3后，与-503/-485处的顺式作用元件结合。TGF-β1通过另外两个转录起始位点(-520、-130)调控MUC1的转录(Zaretsky et al., 1999)。有些研究者认为，在缺少TATA盒子的启动子区域，一些位于启动子区3’末端的GC盒子可激活转录。在MCF7和T47D中GATA-3通过其功能结合位点介导了MUC1的转录上调(Abba et al, 2006)。而HIF-1α通过位于-1488/-1485和-1510/-1507区的顺式作用元件HRE直接调控MUC1的转录(Aubert et al., 2009)。

2膜结合型粘蛋白MUC3的转录调控
MUC3基因位于7q22，已有研究建立了人MUC3和鼠Muc3的启动子结构。MUC3基因ATG上游有多个转录起始位点，跨度180个碱基，MUC3启动子缺乏TATA盒子(Gum et al., 2003)。用荧光素酶报告基因系统携带起始于-775或-623的不同DNA片段检测启动子活性，分别瞬时转染人结肠癌细胞。检测荧光素酶活性发现启动子区-775/+57 具最大转录活性，-775/-62具较大转录活性，而-775/-242仅具有最小转录活性，这也提示包含转录起始位点的启动子在转录活性中发挥一定作用。

鼠Muc3启动子转录起始区域覆盖了起始位点，在转录起始位点附近无TATA盒子，有争议的TATA盒子位于在ATG上游197 bp (Shekels and Ho, 2003)。Muc3启动子区域有AP1、CREB、SP1、NFκB、GATA结合蛋白、Cdx等转录因子的结合位点，研究已证实IL4、IL6、EGF、PMA能上调启动子活性35%~58%。在LOVO细胞和LS174T细胞中应用荧光素酶报告基因系统发现，不同MUC3启动子片段分别表现为不同活性水平，最大活性启动子区分别为-837/-1和-1214/-1，而在不表达MUC3的人肺癌细胞株H2009中没有发现启动子活性。这些都提示MUC3启动子具有组织特异性。鼠Muc3首位两外显子间被8 kb的内含子隔开(Price et al., 2000)，第三个外显子有串联重复单位，其羧基侧有连有十个外显子。

比较鼠Muc3与人MUC3基因发现，两者羧基端有46.4%的氨基酸排列相似，其中有10个外显子组成序列保守(Andrianifahanana et al., 2006)。鼠Muc3基因的EGF1区域与人MUC3的有60%同源，在EGF2区域有44%的同源性，它们都包含8个半胖氨基酸。

3膜结合型粘蛋白MUC4的转录调控
MUC4基因位于3q29，MUC4有4个转录起始位点，分别在-199、-2603、-2604和-2605处(Perrais et al., 2001)。启动子近端富含GC区域而缺少TATA盒子，GC区域是Sp1和CACCC盒子结合蛋白的潜在结合位点。同时，糖皮质激素受体元件、AP-1、PEA3和Med-1结合位点也高度密集。在启动子远端-2672/-2668处有特征性的TATA盒子，存在Sp1、AP-1、AP-4、GATA和cAMP应答元件结合蛋白等大量潜在转录因子的结合位点。同时也包含大量PKA、PKC和cAMP信号通路中的转录因子的潜在结合位点(Jonckheere and van Seuningen, 2010)。在人胰腺癌细胞株Capan-1、Capan-2中发现，-219/-1和-2781/-2572区域均有较高启动子转录活性，并且-219/-1区是最短启动子片段但表现为最强启动子活性。在Capan-1和Capan-2细胞中，Sp1在-2723/-2703处结合其顺式作用元件，而Sp3作用在-173/-150区域。在Capan-2细胞中，Sp3在-461到-1区总体上表现为抑制启动子活性。一些生物活性物如佛波酯、PMA、EGF、TGFα、IFN-γ和TNFα等，对MUC4的启动子活性起到负调控效应。

HNF-1/4、FOXA1/A2、GATA-4/-6和CDX-1/-2在胚胎发育中控制肠内胚层细胞分化，它们也能调控MUC4转录，也可能协同调控。鼠粘蛋白Muc4 的启动子也缺少TATA盒子，在启动子5’侧翼区首个450 bp的碱基与人的MUC4对应序列比对，发现约有70%同源，这可能提示这些序列为启动子的重要基序。

4其它粘蛋白的转录调控
MUC11、MUC12和MUC17基因位于7q22，它们都含SEA和EGFs组件，在MUC12与MUC17基因之间有1 146 bp的基因间隔区，这里包含VDR/RXR、GATA、NFκB和Cdx-2反应元件，在HPAF胰腺癌细胞株中表现为增强子和重要的启动子活性(Moniaux et al., 2006)。MUC13、MUC15、MUC16和MUC20分别定位于3q13.3、11p14.3、19q13.3和3q29上，MUC13含EGFs组件，在幽门螺杆菌侵袭后下调，MUC13可作为胃癌预后的评估标记物(Tsai et al., 2006)。MUC16含有SEA组件, 糖皮质激素受体可介导MUC16在mRNA和蛋白水平上调(Seo et al., 2007)。

5小结与展望
进行基因表达调控的研究，首先要确定启动子和转录因子结合部位。作为基因表达所必需的重要序列信号和基因转录水平上一种重要的调控元件，真核生物的启动子一直是现代分子生物学的研究热点。无启动子的荧光素酶报告基因系统逐渐应用于新基因启动子区域的研究，对膜结合型粘蛋白启动子的研究起到了推动作用，由于膜结合型蛋白的种类多分布广，在多组织癌变过程中表达量发生变化，这提示我们这些粘蛋白将可能作为癌症发生和预后的评估标记。

总结当前对一个新基因的转录调控研究的一般方法，基因启动子分析的基本流程如下：一，克隆目的基因启动子序列：在NCBI、UCSC基因数据库中查找比对出基因的基本启动子序列。二，软件预测顺式作用元件，做点突变分析：将基本启动子序列克隆进pGL3-basic中，转染细胞后测其荧光活性，再在5’非翻译区进行一系列缺失突变，用荧光素酶报告基因系统找到核心启动子序列后，通过TFSERCH、JASPAR等核转录因子结合位点在线软件预测转录因子，初步筛选出发挥作用的顺式作用元件及可能结合的转录因子，进一步采用定点突变的方法研究突变各转录因子结合位点对启动子活性的影响。三，分别用EMSA实验、CHIP实验在体外、在体内验证顺式作用元件同反式作用因子的结合。四，过表达和干扰反式作用因子情况下用RT-PCR验证目的基因的表达情况。虽然正在积极深入研究MUC1、MUC3和MUC4的调控机制，但仍有大量粘蛋白的转录调控信息知之甚少，而对粘蛋白启动子的转录调控研究，应用启动子特点控制粘蛋白的表达将会为多个组织癌症的基因治疗和预后作出重大贡献。

致谢
感谢国家自然科学基金项目(30800519)对本研究的资助。

参考文献
Abba M.C., Nunez M.I., Colussi A.G., Croce M.V., Segal-Eiras A., and Aldaz C.M., 2006, GATA3 protein as a MUC1 transcriptional regulator in breast cancer cells, Breast Cancer Res., 8(6): R64 doi:10.1186/bcr1617 PMid:17078870 PMCid:1797033

Andrianifahanana M., Moniaux N., and Batra S.K., 2006, Regulation of mucin expression: Mechanistic aspects and implications for cancer and inflammatory diseases, Biochimica et Biophysica Acta, 1765(2): 189-222

Aubert S., Fauquette V., Hémon B., Lepoivre R., Briez N., Bernard D., Van Seuningen I., Leroy X., and Perrais M., 2009, MUC1, a new hypoxia inducible factor target gene, is an actor in clear renal cell carcinoma tumor progression, Cancer Res., 69(14): 5707-5715 doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-4905 PMid:19549898

Desseyn J.L., Tetaert D., and Gouyer V., 2008, Architecture of the large membrane-bound mucins, Gene, 410(2): 215- 222 PMid:11084045

Gaemers I.C., Vos H.L., Volders H.H., van der Valk S.W., and Hilkens J., 2001, A stat-responsive element in the promoter of the episialin/MUC1 gene is involved in its overexpression in carcinoma cells, J. Biol. Chem., 276(9): 6191-6199 doi:10.1074/jbc.M009449200 PMid:12958310

Gum J.R.Jr, Hicks J.W., Crawley S.C., Dahi C.M., Yang S.C., Roberton A.M., and Kim Y.S., 2003, Initiation of transcription of the MUC3A human intestinal mucin from a TATA-less promoter and comparison with the MUC3B amino terminus, J. Biol. Chem., 278(49): 49600-49609 doi:10.1074/jbc.M305769200 PMid:19818375

Jonckheere N., and Van Seuningen I., 2010, The membrane-bound mucins: From cell signalling to transcriptional regulation and expression in epithelial cancers, Biochimie., 92(1): 1-11 doi:10.1016/j.biochi.2009.09.018 PMid:17575006

Koga T., Kuwahara I., Lillehoj E.P., Lu W.J., Miyata T., Isohama Y., and Kim K.C., 2007, TNF-alpha induces MUC1 gene transcription in lung epithelial cells: Its signaling pathway and biological implication, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 293(3): 693-701 doi:10.1152/ajplung.00491.2006 PMid:19935676 PMCid:2951677

Kufe D.W., 2009, Mucins in cancer: Function, prognosis and therapy, Nature Reviews Cancer, 9: 874-885 doi:10.1038/nrc2761 PMid:15849214

Kuwahara I., Lillehoj E.P., Hisatsune A., Lu W.J., Isohama Y., Miyata T., and Kim K.C., 2005, Neutrophil elastase stimulates MUC1 gene expression through increased Sp1 binding to the MUC1 promoter, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 289(2): 355-362 doi:10.1152/ajplung.00040.2005 PMid:16737958

Moniaux N., Junker W.M., Singh A.P., Jones A.M., and Batra S.K., 2006, Characterization of human mucin MUC17: Complete coding sequence and organization, J. Biol. Chem., 281: 23676-23685 doi:10.1074/jbc.M600302200 PMid:11418607

Perrais M., Pigny P., Ducourouble M.P., Petitprez D., Porchet N., Aubert J.P., and Van Seuningen I., 2001, Characterization of human mucin gene MUC4 promoter: importance of growth factors and proinflammatory cytokines for its regulation in pancreatic cancer cells, J. Biol. Chem., 276: 30923-30933 doi:10.1074/jbc.M104204200 PMid:10880365 PMCid:1221189

Price S.A., Perez A., Barco R., and Carraway K.L., 2000, Cloning and characterization of the 5’flanking region of the sialomucin complex/rat Muc4 gene: Promoter activity in cultured cells, Biochem J., 349(Pt2): 641-649 doi:10.1042/0264-6021:3490641 PMid:19913432

Senapati S., Das S., and Batra S.K., 2010, Mucin-interacting proteins: From function to therapeutics, Trends Biochem. Sci., 35(4): 236-245 doi:10.1016/j.tibs.2009.10.003 PMid:17592322

Seo K.Y., Chung S.H., Lee J.H., Park M.Y., and Kim E.K., 2007, Regulation of membrane-associated mucins in the human corneal epithelial cells by dexamethasone, Cornea, 26(6): 709-714 doi:10.1097/ICO.0b013e31804f5a09

Shekels L.L., and Ho S.B., 2003, Characterization of the mouse Muc3 membrane bound intestinal mucin 5’coding and promoter regions: Regulation by inflammatory cytokines, Biochim. Biophys. Acta, 1627(2-3): 90-100 PMid:16302265

Singh A.P., Chauhan S.C., Bafna S., Johansson S.J., Smith L.M., Moniaux N., Lin M.F., and Batra S., 2006, Aberrant expression of transmembrane mucins, MUC1 and MUC4, in human prostate carcinomas, The Prostate, 66(4): 421-429 doi:10.1002/pros.20372

Tsai C.J., Herrera-Goepfert R., Tibshirani R.J., Yang S.F., Mohar A., Guarner J., and Parsonnet J., 2006, Changes of gene expression in gastric preneoplasia following Helicobacter pylori eradication therapy, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 15: 272-280 doi:10.1158/1055-9965.EPI-05-0632 PMid:19855405

Turner J.R., 2009, Intestinal mucosal barrier function in health and disease, Nature Reviews Immunology, 9: 799-809 doi:10.1038/nri2653

Vincent A., and Van Seuningen I., 2008, Mucins, epigenetics and cancer. In the epithelial mucins: Structure/Function, roles in cancer and inflammatory diseases, In: Van Seuningen I. (ed.), Research Signpost: Kerala, India, pp.95-108 PMid:18413738

Yamada N., Nishida Y., Tsutsumida H., Hamada T., Goto M., Higashi M., and Yonezawa S., 2008, MUC1 expression is regulated by DNA methylation and histone H3 lysine 9 modification in cancer cells, Cancer Research, 68(8): 2708-2716 doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-6844

Zaretsky J.Z., Sarid R., Aylon Y., Mittelman L.A., Wreschner D.H., and Keydar L., 1999, Analysis of the promoter of the MUC1 gene overexpressed in breast cancer, FEBS, 461(3): 189-195 doi:10.1016/S0014-5793(99)01452-0 PMid:18242885