类黄酮(Flavonoids)化合物是植物中一类重要的次生代谢产物，它以结合态(黄酮苷)或自由态(黄酮苷元)形式存在于水果、蔬菜、豆类和茶叶等许多植物中。类黄酮化合物在植物中有多方面的生理功能，如参与植物花色的形成(Koes et al., 2005)、植物激素运输(Bogs et al., 2006)、豆科植物根与根瘤菌之间的相互作用以及花粉发育等；另外，它对植物也具有保护作用，如紫外光辐射防护及抵抗病原体侵染等(Winkel-Shirley, 2002)；类黄酮化合物也具有重要药用价值，它具有抗氧化，保护心脑血管，抗肿瘤，消炎等功能(李琳玲等, 2008)。槲皮素(Quercetin)是最典型的类黄酮化合物，在其C3位羟基上结合糖分子后，即形成芸香苷(芦丁) (Rutin)；花青素(Anthocyanins)是另一种重要的类黄酮化合物，它包含两个苯环，并由3碳单位连结(C6-C3-C6)，花青素经由苯基丙酸途径和类黄酮生物合成途径生成，由多种酶调控催化。花青素是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一，某些植物的种皮也含有大量的花青素。

查尔酮异构酶最早在花青素生物合成途径中的类黄酮途径中被发现，查尔酮异构酶是类黄酮合成途径中早期的关键酶，它催化查尔酮异构为(2S)-黄烷酮或(2S)-5-脱氧黄烷酮，它和类黄酮代谢途径的另一个关键酶查尔酮合酶(CHS)共同调控类黄酮代谢途径。随着对类黄酮化合物的深入了解和研究，其代谢过程中多种相关酶已被分离研究。深入了解查尔酮异构酶基因在不同植物中序列的保守性及特异性、了解该基因的表达调控，对利用该基因进行基因工程改良提高植物中色素含量以及色素组成，增强植物抗逆性和抗氧化能力具有重要的意义，如在药用植物中增加类黄酮化合物的积累，增强植物抗逆性和抗氧化能力，控制植物花色素的合成，控制类黄酮化合物的含量改善水果的口感等。

近些年来，国内外大量开展对查尔酮异构酶基因的研究。对于草本植物，如花卉以及农作物中查尔酮异构酶基因的研究比较深入。对于查尔酮异构酶基因的结构与功能报道较多，但对于查尔酮异构酶基因的调控研究相对较少。另外，近年来研究者不仅在药用以及观赏植物中进行查尔酮异构酶基因的改造，已有报道表明蔬菜水果的口感，甚至是亚麻等材料植物的改良都与查尔酮异构酶基因有关，说明此基因的更多功能还有待进一步探索。

1植物查尔酮异构酶的催化反应及其分类

查尔酮异构酶是类黄酮化合物代谢途径中的限速酶之一，它催化的底物为查尔酮或6-脱氧查尔酮。查尔酮异构酶催化分子内环化反应，反应需要底物具有2’位羟基(Jez et al., 2000)。反应过程为底物查尔酮2-羟基的去质子化，产生氧负离子，负离子对α, β-不饱和双键的β-碳原子进行亲核攻击，最后产生2-酸性羟基基团，从而完成整个反应。该反应可以在没有查尔酮异构酶的情况下自发进行，但是反应速率很慢，在查尔酮异构酶的催化作用下反应速率可以达到自发反应速率的107倍(Bednar and Hadcock, 1988)，而且能优先形成具有生物活性的(2S)-黄烷酮。

根据其作用底物的不同，一般将查尔酮异构酶分成两类(Shimada et al., 2003)，Type I型查尔酮异构酶仅能催化6-羟基查尔酮转化为(2S)-黄烷酮或(2S)-5-脱氧黄烷酮，这类查尔酮异构酶存在于黄瓜，大麦，油菜，拟南芥，水稻等植物中(Liu et al., 1995; Druka et al., 2003)。Type II型查尔酮异构酶除能将查尔酮异构化为(2S)-5-脱氧黄烷酮之外，还能将6-脱氧查尔酮异构化为(2S)-黄烷酮或(2S)-5-脱氧黄烷酮，这类查尔酮异构酶主要存在于豆科植物中。两类查尔酮异构酶都具有保守的查尔酮催化结构域，由大约200个氨基酸组成，两种类型同时具有多个保守的氨基酸残基(Shimada et al., 2003)。另外，从真菌、粘土霉菌和γ蛋白细菌中分离出另一类查尔酮异构酶，被归类于Type III型(Gensheimar and Musheglan, 2004)。

2植物查尔酮异构酶基因的克隆及序列分析

在植物中，CHI基因的cDNA序列首次通过抗血清方法从菜豆中克隆，该基因编码27 kD蛋白，以单体的形式存在(Mehdy and Lamb, 1987)。用相同的方法从矮牵牛中克隆到CHI基因(van Tunen et al., 1988)。之后，用同源克隆的方法从菜豆、玉米、大豆、水稻、大麦、豌豆、紫花苜蓿、水母雪莲、葡萄、拟南芥、金鱼草、甘草、康乃馨、萝卜、美人蕉以及茶属植物 (Bednar and Hadcock, 1988; Blyden et al., 1991; Grotewold and Peterson, 1994;Wood and Davies, 1994; McKhann and Hirsch, 1994; Kimura et al., 2001; Druka et al., 2003; Li et al., 2006; 马春雷等, 2007; 张党权等, 2007; 李军等, 2006; 周军等, 2009)等不同植物中克隆到CHI基因。这些研究以草本植物和花卉为主，这主要是因为该基因是植物色素形成的关键基因，而植物色素积累的多少及种类与观赏植物经济价值直接相关。

到目前为止GenBank中登陆的CHI基因相关序列大约有600条，其中240多条为cDNA序列，150多条为基因组序列，其余为EST序列。它们分别来自40多种不同植物。分析以上不同来源的CHI基因的序列，发现CHI 基因的cDNA序列的同源性一般为42%~65%，不同物种间CHI基因的相似性比较高。对Type I和Type II类的CHI基因进行内部比对，发现Type I类CHI基因一般含有4个外显子和3个内含子，如玉米，水稻，拟南芥等；而Type II类CHI基因一般含有3个外显子和2个内含子。油菜中的BnCHI-2基因属于Type I类CHI，却含有5个外显子(许本波, 2006, 西南大学博士论文)，而同属于Type I类的大麦的CHI基因只有3个外显子(Druka et al., 2003)。

某些植物中不止含有一种CHI基因，如从矮牵牛中克隆得到的两类CHI的基因组DNA，一个长726 bp，编码241个氨基酸；另一个长2 170 bp，编码220个氨基酸(van Tunen et al., 1988)。豆科植物甘草中同时存在两种类型的CHI基因(Kimura et al., 2001)。光叶百脉根的LjCHI-2基因属于Type I类，是第一例被发现存在于豆科植物中的Type I类CHI基因(Shimada et al., 2003)。在百脉根中，CHI1基因由4个外显子组成，且各个外显子均高度保守；而CHI2基因在染色体上与CHI1基因方向相反并只有3个外显子，其中第一个外显子接近同源Type II类CHI基因的第1和第2外显子的总长度，第2和第3个外显子分别与同源Type II类CHI基因的第3个和第4个外显子的长度基本相等。Shimada等(2003)认为Type I类CHI基因第1个外显子在复制时插入了1个内含子，被断成了2个外显子，这样就形成了Type II类CHI基因的结构。另外，McClean和Lee (2007)发现，不同品种的大豆，其CHI基因的5’非翻译区(5’UTR)表现单核苷酸差异(SNP)，而第3个内含子不仅表现出SNP，还有核苷酸的插入和缺失，且5’UTR的变异表现的比第3个内含子更明显。Kuittinen和Aguadé (2000)分析了全世界24种生态型的拟南芥CHI基因，并未发现CHI区域二态性的证据。CHI基因可能在整个进 化过程中是趋于保守的，其同源性很高(颜华等, 1997; Springob et al., 2003)。

利用ClustalW 1.83程序(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)对不同植物CHI氨基酸序列进行对比，利用BoxShade(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) 程序将蛋白序列中相似和相近的氨基酸残基用不同颜色标出，比较发现植物CHI蛋白具有较高的同源性，均具有约200个氨基酸组成的查尔酮结构域，其活性位点和与底物的结合区域较保守，N-端和C-端的序列具有氨基酸种类和长度上的差异，这些差异往往与蛋白质的亚细胞定位和不同植物的特异性功能相关。CHI蛋白两种类型间差异较大，其中Type II类型均存在于豆科植物中，而Type I类型几乎在所有植物中都能找到，如百脉根、大豆和苜蓿中均存在两种类型的CHI，不同类型CHI与底物结合的决定性氨基酸残基具有明显差异(图1)。

图1 植物CHI蛋白氨基酸序列比较

将来源于不同植物的18种CHI蛋白序列进行进化树分析。结果表明，两种类型的植物CHI蛋白各自聚为一类，其中Type II类型CHI都来自于豆科植物且遗传距离较近。Type I类型中金鱼草的CHI与其他植物的差别较大；单子叶植物如玉米和水稻的CHI聚为一类；同科植物CHI相似性高，如茄科的烟草和矮牵牛；豆科的大豆、百脉根和苜蓿的Type I类型CHI蛋白聚为一类(图2)。

图2 植物CHI蛋白进化树分析(标尺指示进化距离)

CHI基因的启动子只在矮牵牛，百合，烟草等少数草本植物中被克隆，其中研究最深入的是矮牵牛的启动子。矮牵牛CHI-A和CHI-B基因的启动子不同，CHI-A的启动子区域是由2个具有各自独立功能的启动子PA1、PA2串联形成的，而CHI-B则只有一个启动子PB。分析GenBank中搜索得到的矮牵牛CHI-A基因的启动子序列，并在http://www.dna.affrc.go.jp/PLA¬CE/signalscan.html进行上游顺式元件的预测，启动子中存在CAAT box，GATA box，TATA box等启动子基序，另外，还有ACGT-Motif，E-BOX等特异启动子基序。

3植物查尔酮异构酶基因的表达调控及在基因工程中的应用

CHI基因的表达具有多样性。CHI基因的表达随发育时期的变化而不同。如在矮牵牛中CHI-A在成熟花粉粒中表达，而CHI-B在花药发育早期表达(van Tunen et al., 1988)；在葡萄的果皮中，CHI在花后的30 d和90 d表达水平较高，在其它时期表达水平较低(周军等, 2009)；在红色葡萄果实发育过程中，CHI基因主要在花后2~4周的果皮中表达，而后表达减弱，之后，随着果实颜色加深，其表达加强(Boss et al., 1996)。CHI基因的表达部位是多样的，如矮牵牛中的CHI-A基因的启动子PA1启动CHI-A在花冠中表达，而PA2则启动CHI-A在成熟花粉粒中表达(van Tunen et al., 1988)；在葡萄中，CHI基因在果皮、果肉和种子中都有表达(周军等, 2009)；在苜蓿中，CHI基因在根尖和幼根中表达水平较高，在子叶和花中表达水平较低(McKhann et al., 1997)。

CHI基因的表达是受环境条件诱导的，植物在进化过程中通过在表皮细胞中积累花青素等类黄酮物质以减轻太阳射线的伤害。研究证明，日光和近紫外线UV-A可以诱导津田芜菁块根皮中CHI基因的表达和花青素的积累(Zhou et al., 2007)；矮牵牛中，CHI-A在紫外线照射的幼苗中表达。在花冠、球茎和花药的发育过程中，CHI的积累和消失受光调控和紫外辐射诱导(van Tunen et al., 1989)。而在黑暗下，CHI的表达水平会降低，进行套袋处理的杨梅，其中的花青素的积累会被强烈抑制，通过检测发现这是由于杨梅中CHI的表达量降低造成的(Niu et al., 2010)。在葡萄的根中，CHI基因的表达受温度的诱导，高温处理的幼叶和幼根中CHI基因都有表达(周军等, 2009)；损伤会增强苜蓿子叶中CHI基因的转录水平(McKhann et al., 1997)。

已经发现多种转录因子对花青素等类黄酮物质的合成途径及CHI基因的表达有调控作用。Butelli等(2008)将从金鱼草中克隆的MYB家族和bHLH家族的转录因子同时转入番茄，使番茄中花青素含量明显提高，转基因番茄变为紫色，其中花青素的浓度已与黑莓和蓝莓相当，这些转录因子提高了植物体内CHI蛋白的活性。拟南芥中的PAP1基因属于MYB家族的转录因子，过量表达PAP1基因，拟南芥中花青素和槲皮素及其衍生物含量明显上升，用基因芯片检测转基因拟南芥中的2万多个基因，发现大多数类黄酮合成途径中相关酶的基因表达水平上调，其中包括CHI基因(Tohge et al., 2005)。将葡萄中的VvMYB5a转录因子过量表达，可使葡萄雄蕊中CHI基因的表达量明显高于野生型(Deluc et al., 2006)。将玉米中的转录因子基因LC和C1转入番茄中，转基因番茄果肉中的类黄酮含量大幅增加，并且都是以糖苷的形式存在。转基因番茄中类黄酮合成途径中的相关酶基因表达水平大都上调，但CHI基因表达水平未受影响(Herles et al., 2004)。

3.2植物CHI基因工程改良

通过基因工程改变CHI基因的表达以改变植物类黄酮物质积累的研究已有大量报道。主要集中在花色的改变和果实营养成分的改变。突变矮牵牛花药特异性CHI基因的启动子，导致CHI基因表达水平下降，查尔酮积累改变，花粉颜色变成黄色或绿色(van Tunen et al., 1991)。将洋葱中的CHI基因失活，植株中高水平积累查尔酮，黄酮合成途径被阻断，黄酮含量明显减少，伴随出现黄色的球茎(Kim et al., 2004)。抑制翠菊、仙客来和康乃馨中CHI基因的表达水平，花瓣中会积累大量查尔酮，花朵变为黄色(Kuhn et al., 1978; Forkmann and Dangelmayr, 1980;Miyajima et al., 1991)。用RNA干扰技术直接抑制烟草中CHI基因的表达，植株中黄酮含量降低，花粉和花瓣颜色变淡(Nishihara et al., 2005)。

将矮牵牛CHI-A基因在番茄中过量表达，转基因番茄果皮中黄酮含量比野生型增加76倍，果肉中黄酮醇也比野生型增加21倍，黄酮物质含量的大幅度提高，并未导致其他不良性状的产生(Muir et al., 2001)。将水母雪莲CHI基因在烟草中过量表达，转基因烟草中总黄酮含量有了明显提高，主要是芦丁含量的增加；而将其反义基因转入烟草，抑制了烟草内源CHI的表达，转基因烟草中总黄酮积累减少(Li et al., 2006)；乌拉尔甘草的发状根中黄酮含量较少，通过转基因的方法增强CHI基因的表达，黄酮的含量有了明显的提高，黄酮的含量与CHI的活性呈明显的正相关(Zhang et al., 2009)。

将CHI基因与其它基因同时转入植物，会显著改变植物类黄酮积累的水平。将CHI基因与CHS基因、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因同时转至马铃薯中过量表达，可以大幅度提高花色素苷等黄酮化合物的含量，改善马铃薯的抗氧化能力(Lukaszewicz et al., 2004)。将CHI和黄酮合成酶(FNS)基因在番茄果皮中过量表达，槲皮素的含量比野生型番茄增加了15倍，果皮中查尔酮的含量也显著高于仅过量表达CHI的番茄(Schijlen et al., 2006)。通过改变葡萄柚中CHI的表达来减少黄酮苷的积累，从而减少果实的苦味，获得口感更好的果实(Koca et al., 2009)等。通过控制亚麻中CHI的表达可改变亚麻材料的组成成分，从而改变亚麻的品质(Skórkowska-Telichowska et al., 2010)。在CHI基因工程研究方面已经取得了重要进展，迄今，无论是直接还是间接改变CHI基因的表达水平，都没有发现对植物产生不良影响。

4展望

尽管对CHI基因克隆、表达调控和基因工程等方面的研究已经取得了较大的进展，仍然有许多问题有待于更深入的研究。类黄酮合成途是非常复杂性代谢途径，它又和苯丙酸途径相互影响，在苯丙酸途径中，丙二酰CoA是合成查尔酮的底物之一，而丙二酰CoA是脂肪酸合成的重要底物，这无疑增加了代谢途径相互作用的复杂性。对CHI而言，不同的CHI可以识别不同的底物，而最新的研究显示，CHI在花青素的两条途径中，不只在类黄酮合成途径中起作用，在苯丙酸途径中也发现了CHI。在泥浮萍中，黄酮的积累量是与CHS和CHI的表达量都成正比的(Akhtar et al., 2010)。在大豆的根中，CHI被证明影响苯丙酸类化合物的合成(Klink et al., 2009)。可见，CHI基因不仅仅在黄酮合成途径中起作用还参与其它合成途径。在利用基因工程改良植物黄酮类物质含量或花青素含量时，人们通常只改变一个基因，如过量表达CHI或抑制CHI的表达，而一个酶只催化复杂代谢途径中的一步反应，然而整个代谢途径的效率、不同酶的协调效应、底物的供应、产物在细胞中的浓度等因素均能直接或间接的影响这些产物积累。多基因的转化能够更有效的促进植物中黄酮类物质积累就充分说明了这个问题。因此，深入研究代谢途径中关键酶CHI的性质、类黄酮代谢途径的调控、不同次生代谢途径的互作(黄酮类合成途径和苯丙酸合成途径)、次生代谢途径与初级代谢途径(如苯丙酸途径和脂肪酸途径)的相互影响，深入了解其调控和互作的机理，能为我们利用基因工程改变植物中类黄酮物质的含量，改善植株的抗病性、抗逆性、培育高黄酮含量的药用植物等研究开辟更有效的途径。

参考文献