有“生命之糖”称号的海藻糖(trehalose)所具有的非特异性的保护功能引起了世界范围内的研究热潮(李庆业等, 2008)。海藻糖是一种双糖，又名茧蜜糖、蘑菇糖或漏芦糖，不仅可以作为生物体内的能量贮备，也可以保护体内完整细胞免受外界恶劣条件的侵害，最值得关注的是海藻糖具有抗逆、抗寒、抗旱、耐高温、吸水、低甜度、保湿衣及生物保护等特点，使得它在食品、保健品、医药、化妆品以及农业等方面有很大的应用前景(李坤等, 2007)。海藻糖是在动物、植物、微生物中广泛分布的一种低聚糖，特别是在酵母中含量十分丰富，由于酵母易于培养，生长较快，故酵母就已成为制备海藻糖的重要原料。

目前，正在研究和开发的海藻糖制备方法主要有微生物抽提法、发酵法、酶转化法以及基因重组法(胡宗利等, 2004；Cho et al., 2006)。而我国工业化生产主要是通过酵母菌发酵抽取而得，其产量一般较低(赵玉巧, 2010)。本研究以本实验室分离的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Y-7-1为出发菌株，对其进行多次紫外及化学诱变，筛选出的高产海藻糖的优良稳定性菌株具有潜在的应用价值。

1结果与分析
1.1紫外诱变适宜剂量的选择
在相应条件下(15 W紫外灯, 30 cm照射距离)的紫外线照射时间作为诱变剂量，适宜剂量则以Y-7-1菌株的致死率为指标进行选择。紫外线照射剂量与Y-7-1致死率关系如图1所示。由图1可以看出，Y-7-1菌株对紫外线敏感，致死作用明显。在诱变育种工作中，则倾向采用较低的剂量。本研究应用紫外线对Y-7-1进行处理，选定70 s、100 s (对应致死率分别为70%, 90%)作为适宜的诱变剂量，对Y-7-1进行紫外诱变。

图1 紫外诱变致死曲线

1.2化学诱变适宜剂量的选择
从图2可以看出，随着化学诱变剂硫酸二乙酯处理时间的延长，致死率也随之升高。依据同理，选择11 min、15 min (对应致死率分别为70%, 80.4%)，作为适宜的诱变剂量，对Y-7-1进行化学诱变。

图2 化学诱变致死曲线

1.3诱变筛选结果
通过紫外诱变90 s→紫外诱变90 s→紫外诱变70 s→紫外诱变70 s→化学诱变→化学诱变→紫外诱变70 s为路线，每次筛选出两株优良菌种进入下一轮诱变，进行7次诱变，发酵液稀释200倍测海藻糖含量，结果如表1所示。

表1 7轮诱变筛选的结果

从表1可以看出，原始对照菌株干菌体含海藻糖为6.77%，经过多次反复诱变，产海藻糖最高的Y-7-5干菌体含海藻糖能达到20.15%，每毫升发酵液产海藻糖约0.796 mg，生产性能提高了2.98倍；另一个出发菌株诱变的Y-7-7，产量高又稳定，干菌体含海藻糖量为19.67%，每毫升发酵液产海藻糖约0.890 mg，性能也能提高2.86倍。而Y-7-3*虽然产量较高，但方差分析分析发现，重复间稳定性较差，和对照差异不显著。因此，菌株Y-7-5和Y-7-7具有较高的生产性能和稳定性，并对这两株酵母菌进一步进行产海藻糖稳定性试验。

1.4稳定性试验结果
海藻糖产量最高的两个菌株Y-7-5和Y-7-7经过连续传代培养7代后，每代菌株发酵后，发酵液稀释500倍测其海藻糖的含量。由表2可见，菌株Y-7-5基本稳定，有两代数据有些异常，第2代海藻糖含量偏低，第7代海藻糖含量偏高，第4、第5、第6代比较稳定，经过分析，异常数据是由于试验误差所导致的。所以菌株Y-7-5产海藻糖性能稳定，可以作为生产海藻糖的新菌株。

表2 菌株Y-7-5稳定性试验结果

由表3可见，菌株Y-7-7除第5代海藻糖含量有点偏高之外，其它各代海藻糖含量都比较稳定，所以菌株Y-7-7其产海藻糖性能稳定，也可以作为生产海藻糖的新菌株。

表3 菌株Y-7-7稳定性试验结果

2讨论
紫外线是最常用的物理诱变剂，可以导致DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体，使DNA复制出现差错，从而诱发突变。硫酸二乙酯作为一种较易控制变量的化学诱变剂，可使DNA部分烷基化，破坏DNA分子，从而引起诱变。但菌种经过同一诱变方法反复诱变处理，因诱变机理相同就会出现饱和效应或回复突变现象。本研究区别于以往仅使用单一物理或化学诱变和简单的物理化学复合诱变方法，尝试以紫外-化学复合反复交替诱变，显著提高了酿酒酵母中海藻糖的产量。通过诱变所得的突变株Y-7-5﹑Y-7-7和原始对照株同一条件下经发酵培养后比较，每毫升发酵液产海藻糖分别为0.796 mg和0.890 mg，生产性能分别是原始菌株的2.98倍和2.86倍，较单一使用同种诱变(方尚玲等, 2007)和简单的物理化学诱变方法(张丽杰等, 2005)其干菌体含海藻糖量显著提升，且保持良好的遗传稳定性。在此基础上可进行发酵条件优化，以进一步提高海藻糖产量。

3材料和方法|
3.1原始出发菌株
酿酒酵母Y-7-1 (Saccharomyces cerevisiae Y-7-1)来源于应用与环境微生物实验室筛选菌株。

3.2培养基
PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000mL，pH自然，121℃湿热灭菌30 min。

种子培养基：蔗糖30 g，酵母浸出膏4 g，(NH₄)₂SO₄ 4 g，KH₂PO₄ 3 g，NaCl 5 g，MgSO₄ 2 g，H₂O 1 000 mL，pH 6.8，121℃湿热灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖30 g，酵母膏4 g，(NH₄)₂SO₄ 4 g，KH₂PO₄ 3 g，NaCl 5 g，MgSO₄ 2 g，H₂O 1 000 mL，pH 6.8，121℃湿热灭菌30 min。

3.3菌株的诱变处理
采用70%~75%低致死率的相对剂量，有利于微生物菌株正向突变(赵玉巧, 2010)。紫外诱变中，以相应条件下(15 W紫外灯, 30 cm照射距离)的紫外线照射时间作为诱变剂量(张丽杰等, 2005)，化学诱变则以硫酸二乙酯的处理时间作为诱变剂量，以菌株Y-7-1的致死率为指标选择适宜的剂量。

化学诱变参照方尚玲等(2007)的方法进行。分别吸取5 mL 0.1 mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液制成的约为1×10⁶个/mL的菌悬液至一系列无菌具塞小号试管中，精确吸取100 μL硫酸二乙酯加入待处理的菌液中，使硫酸二乙酯在菌悬液中的浓度为2.0% (V/V)，并分别计时振荡。依次振荡处理后，立即加入1 mL的25%硫代硫酸钠溶液终止反应。为确保诱变反应终止的完全，采用双终止法，即加入终止试剂后立即稀释1 000倍，再依次梯度稀释。

通过以紫外诱变90 s→紫外诱变90 s→紫外诱变70 s→紫外诱变70 s→化学诱变→化学诱变→紫外诱变70 s为诱变路线，每次筛选出两株优良菌种作为下一轮诱变的出发菌株，共进行7次紫外和化学反复交替诱变。

3.4菌株的筛选
3.4.1初筛
海水样品在5 000 rpm离心15 min得海水沉淀物(海泥取适量, 海洋鱼贝类取内脏)，接种到液体富集培养基中培养。培养条件为30℃、165 rpm、72 h。液体富集培养菌悬液在平板富集培养基上划线分离单菌落，培养条件为30℃、48 h。将分离得到的单菌落接种到发酵培养基中，于摇床中165 rpm，30℃培养60 h，用纸层析法确定产海藻糖酵母10余株，编号后保存在PDA斜面培养基上，培养条件为28℃、24 h (赵玉巧, 2010)。

3.4.2复筛
种子液制备：取两环经斜面培养用于复筛的菌株，无菌操作条件下接入装有3 mL液体培养基的试管中，30℃、165 rpm下摇瓶培养1 d，得到液体种子。然后，在250 mL三角瓶中装入50 mL的液体培养基，灭菌后接种(接种量为6%)，30℃、165 rpm下摇瓶培养60 h后，5 000 rpm条件下离心收集菌体，用无菌水洗2次，所得湿菌体盛于干净的平皿内放入烘箱干燥(60℃)后称干重(方尚玲等, 2007)。

3.5海藻糖提取与分析方法
用海藻糖标准品制作标准曲线(图3)，当海藻糖质量在10~80 mg/L范围内，曲线的线形关系良好，其回归方程为y=0.008 2x (x为海藻糖浓度, 单位: mg/L; y为OD值)。用三氯乙酸法抽提样品海藻糖(Stambuk, 1996)，以所制作标准曲线为参照，用硫酸蒽酮法测定并计算海藻糖的含量(Kato, 1996; Tan, 2006)。

图3 海藻糖标准曲线

3.6生产性能稳定性实验
选取海藻糖含量最高的菌株，斜面上培养24 h (即为第1代)，并接2瓶种子培养基作为平行，经摇瓶发酵60 h后测其海藻糖的含量，对比原菌株的含量，看是否相差大，是否稳定。依次传代7代，观察是否稳定。

作者贡献
吴晓彤是试验的主要完成人，负责试验的设计及菌株的所有诱变育种及论文撰写。刘起丽为试验主要参与者，负责菌株紫外诱变及筛选。张建新为通讯作者，项目负责人，负责实验设计及论文的修改。赵丹丹是试验主要参与者，负责菌株化学诱变及筛选。韩科芳和朱岩昆负责海藻糖的提取及含量检测。

致谢
在此要特别感谢河南省重点科技攻关(112102110118)，河南省教育厅科技攻关(2010A180014)，河南师范大学生命科学实验教学示范中心项目的资助。感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

参考文献
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