花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料和经济作物，果针是花生特有的组织结构，是实现花生地上开花、地下结荚的器官，果针能否入土，关系到花生能否正常结果。因此，果针生长发育的生物学特性引起许多学者的重视。目前对于果针的研究主要集中于栽培(张海燕等, 2004)及生长发育方面(贺立红等, 2006)。花生果针分子生物学方面的研究报道甚少，目前对于控制花生果针结构、生长发育以及其它特性的基因表达调控情况还是一片空白。

cDNA文库的构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，是目前发现新基因和研究基因表达的基本工具(朱利军等, 2009, 海南大学学报自然科学版, 27(2): 185-190; 董志敏等, 2006, 作物杂志, (5): 1-4)。例如郭俣等(2010)人利用油鸡cDNA文库成功筛选并鉴定了purH基因的表达情况。全长cDNA文库的构建可以高效、大规模获得基因序列，能大幅度地加快计算机分析蛋白质表达和功能的进程，是进行基因组研究的一条重要途径(董志敏等, 2006)。目前，全长文库构建方法已比较成熟，报道的技术方法有Oligo-Capping法(Maruyama and Sugano, 1994)、CAPture法(Edery et al., 1995)、CAP-trapper法(Carninci et al., 1996)、SMART法(Chenchik et al., 1996)、Cap-Select法(Schmidt and Mueller, 1999)和CAP-jumping法(Fimove et al., 2001)等。近年来，许多研究者致力于全长文库的构建，拟南芥(Seki et al., 1998)、水稻(刘运华等, 2007)、花生(蔡宁波等, 2007)、甘蔗(许莉萍等, 2009)和鹿茸(郝丽等, 2009)等均有全长文库的报道，获得了大量的数据，完善了各种文库构建方法，极大的促进了功能基因组学的研究。然而，各种文库构建方法各有优缺点，综合比较而言，SMART法因其具有简单、快速的特点已广泛应用于一般质量cDNA文库的构建。Clontech公司改进的“SMART”法使构建文库所需的RNA量减少，大约只需50 ng总RNA即可构建完整的cDNA文库(储昭晖等, 2002, 科学通报, 47(21): 1656-1662)。

本文利用SMART技术成功构建了花生果针全长cDNA文库，该文库可用于克隆和鉴定一批功能基因全长cDNA序列，为开展果针重要基因的功能研究奠定了基础，将有利于进一步从分子水平深入阐明果针生长发育的分子机理。

1结果与分析
1.1总RNA的提取结果
利用本实验室改良的CTAB法提取的花生果针总RNA经1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果(图1)显示，28S rRNA和18S rRNA条带清晰，说明提取的总RNA质量较高。紫外分光光度计检测所提RNA纯度，其OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.97，OD₂₆₀/OD₂₃₀值为2.32，获得了高纯度的RNA，满足文库构建的要求。

图1 花生果针总RNA电泳图

1.2 dscDNA的合成
3 μg总RNA起始第一链合成后采用LD-PCR法合成的ds cDNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，ds cDNA片段条带呈现分布在0.2~3.0 kb (图2)之间的弥散状条带，主要集中于750 bp以上，条带清晰、正常且产物的量足，说明合成了较高质量的双链cDNA，可用于cDNA文库的构建。

图2 花生果针dsDNA电泳图

1.3文库质量的鉴定
双链经蛋白酶K消化、Sfi Ⅰ酶切、连接载体、电击转化后涂板，计数培养板单克隆数，经计算原始文库得到1.23×10⁶个重组子。随机挑取15个单菌落摇菌，进行菌液PCR扩增，电泳结果显示(图3)，其中含有两个双插入，重组率达100%。随机挑取10个单克隆过夜摇菌后提取质粒，酶切后电泳(图4)显示，6个单克隆的插入片段大小在1.0~2.0 kb之间，所占比例为60%，插入片段平均大小在1.0 kb左右，达到文库质量要求。扩增文库经不同稀释倍数稀释后涂板过夜培养，经计算扩增文库滴度结果为3.82×10⁹ cfu。以上数据表明该文库为较高质量的cDNA文库，可作为筛选和克隆果针特异表达基因基因、研究果针发育分子机理的平台。

图3 花生果针全长cDNA文库菌液PCR电泳图

图4 花生果针全长cDNA文库单菌落质粒酶切电泳图

 
1.4文库随机测序及生物信息学分析结果
随机挑选文库30个单克隆进行双向测序，利用DNA序列常规分析软件BioXM 2.6分析测序结果，共有22个基因测通，且均具有开放阅读框结构。借助生物信息学技术判断序列是否为全长，结果有9个为全长序列，比率为40.9%。利用BLASTN和BLASTX程序(http://blast. ncbi nlm. nih. gov/blas.t cgi)进行同源性检索，初步确定基因的功能，所测序列包含结合类蛋白、氧化系统蛋白、结构蛋白、转录因子、抑制类蛋白、酶类蛋白和过敏原等基因(表1)。

表1 文库随机测序序列生物信息学分析结果

2讨论
要成功构建一个全长cDNA文库，获得高质量的RNA是前提。而影响总RNA质量的因素主要有3个：一是否有降解；二是否有污染(DNA、蛋白质和小分子物质)；三是否完整，即包括生命体所有基因的转录产物。花生富含酚和多糖等物质，使用RNA提取试剂盒或者其它通用RNA提取技术都很难获得高质量的RNA，本实验室改良的CTAB法提取花生RNA虽然耗时较长，但提取的RNA纯度较高。本实验所提取的果针RNA 28S、18S和5.8S 3条条带清晰，经紫外分光光度计检测，OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.97，OD₂₆₀/OD₂₃₀=2.32说明所提取的RNA较纯，没有降解，没有蛋白质等分子污染，可成功应用于该文库的构建。

构建高质量的全长cDNA文库要求获得高质量的全长cDNA。本实验应用SMART方法，以3 μg总 RNA为模板起始第一链的合成，采用LD-PCR法合成双链可保证获得的cDNA序列的完整性。王淑红等经过大量测序证实了SMART法对cDNA序列的完整性的保证(王淑红等, 2008, 台湾海峡, 27(3): 278-285)。

cDNA文库的质量具体反映在两个方面：文库的库容量和插入cDNA片段的大小(易朝辉, 2010)。本实验所构建的原始cDNA文库具有的独立克隆数为1.3×10⁶个，包括了大部分稀有的mRNA，可以满足大规模测序和筛选所用；插入片断均大于750 bp，60%的插入片段高于1 000 bp，平均长度为1.0 kb，保证了高比例全长cDNA的获得。

本实验利用SMART技术成功构建了高质量的花生果针全长cDNA文库，滴度测定、重组率、PCR鉴定结果均符合cDNA文库的质量要求。随机测序序列生物信息学分析表明本文库包含各类基因，全长率较高，可用于花生果针功能基因的筛选和测序。本文库的构建为下一步果针功能基因的研究以及筛选、克隆果针次生代谢产物合成途径相关基因奠定了基础。

3材料与方法
3.1材料
本研究选用福建农林大学油料作物所选育的优良花生品种闽花6号在大田种植入土前果针为材料，-70℃冰箱保存备用。

文库构建试剂盒CreatorTM SMART^TM cDNA Library Construction Kit购自Clontech公司。Primer Script Reverse Transcriptase、Ex Taq，dNTP，DL2000分子标准、DL15000分子标准和大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自大连宝生物公司(TAKARA)。胶回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司(BIOER)。其它试剂采用国产分析纯。

3.2花生果针总RNA的提取
取5 g花生果针于液氮预冷的研钵中研磨成粉状，转移至65℃含预热CTAB的离心管中，水浴20~30 min，氯仿/异戊醇抽提2次后，上层水相加入LiCl沉淀总RNA。4℃12 000 g离心30 min，将沉淀物溶于50 μL DEPC水即获得总RNA。总RNA经紫外分光光度计检测浓度及纯度，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

3.3 cDNA单链和双链的合成
单链cDNA的合成：取3 μg总RNA于DEPC处理离心管中，按照SMART文库构建试剂盒说明加入相应的引物和试剂合成cDNA第一链。采用LD-PCR法合成双链cDNA。按照SMART文库构建试剂盒说明添加单链模板、酶、引物及dNTP后用双蒸水补足至25 μL。反应在已预热到95℃的PCR仪上进行。反应程序：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，68℃复性30 s，72℃延伸5 min，共8个循环；72℃延伸10 min。取2 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测其质量。

3.4蛋白酶K与Sfi I限制性酶切消化及文库构建
50 μL双链cDNA的PCR产物经蛋白酶K消化后抽提两次，用80%乙醇室温沉淀。沉淀溶于79 μL去离子水中，加入15 μL Sfi Ⅰ酶于50℃水浴酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收750 bp以上片段。回收产物经乙醇、糖原-20℃共沉淀后溶于7 μL去离子水，-70℃保存备用。

回收产物在T4 DNA连接酶作用下，与质粒载体pDNR - LIB(经 Sfi Ⅰ酶处理)连接，电击转化入感受态细胞(大肠杆菌DH5α)后迅速转移至LB培养基中，37℃ 225 r/min震荡培养1 h获得原始文库。大肠杆菌感受态细胞的制备和连接转化等操作参考分子克隆实验指南(萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)。

3.5原始文库质量的鉴定
取1 μL原始文库菌液至99 μL液体LB培养基中混匀，均匀地涂在含30 mg/L氯霉素的LB培养板上。计数过夜培养板单克隆数，原始文库库容(pfu)=生长克隆数×10³。

随机挑取15个单菌落，过夜摇菌后做菌液PCR鉴定文库重组率。随机挑取11个单菌落过夜摇菌后提取质粒，质粒经SfiⅠ酶切后在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测文库cDNA插入片段的大小。随机挑取30个单菌落做穿刺stock并送上海国家人类基因组南方研究中心进行双向测序。

3.6文库的扩增及滴度的检测
依据原始文库库容，将原始文库菌液均匀地涂在几个含30 mg/L氯霉素的LB培养板，37℃过夜培养。每个培养板用10 μL液体LB培养基洗脱后混匀，即为扩增文库。加入等量50%甘油混匀后分装，-80℃保存。
取1 μL扩增文库菌液，稀释10³、10⁴和10⁵倍后吸取100 μL均匀地涂在含30 mg/L氯霉素的LB培养板，37℃过夜培养。文库的滴度公式(cfu)=(平均每个培养板中单菌落数×1 000 μL/mL)/涂布稀释的菌体体积(μL)。

3.7序列分析
30个随机挑取的单克隆测序后，依据引物序列去除载体序列，利用DNA序列常规分析软件BioXM 2.6进行拼接，分析其开放阅读框(open reading frame, ORF)和非编码区(untranslated regions, UTRs)，最后利用BLASTN和BLASTX程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行同源性检索，初步确定基因的功能。

作者贡献
姜宝杰为本文章主要完成人，该文章所涉及的实验及文章写作是在在庄伟建老师的指导下完成的，同时陈华、邓烨、曾建斌、张冲及贺小彦等同学为实验提供了技术和操作上的帮助，在此一并表示感谢。

致谢
本实验得到了福建省科技厅：基因工程改良花生油亚比(O/L)的研究(2008I0002)的资金支持，再次表示感谢。同时感谢两位匿名同行评审人的评审意见和修改建议。

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