针对化肥、传统有机肥和生物肥料的优缺点，开发新型的生物有机无机三元复合肥成为现代肥料生产中的热点之一(张辉等, 2005)。其中具有特定功能的微生物的生命活动是使该肥料优于其它肥料的关键因素(李庆康等, 2003)。而微生物发酵后与有机肥、无机成分混合造粒过程中，无法避免氮、磷、钾肥料对微生物的杀伤作用，有效活性菌很难存活，尤其是高氮对微生物的杀伤更大(葛诚, 2007)。因此功能微生物对无机盐的耐受能力成为制约新型生物有机无机复合肥产业发展的关键问题。

有研究表明通过驯化可以大大增强微生物的耐盐能力(余宗学等, 2008)。细菌对渗透压的变化有较强的适应能力，也就是说有较大的可塑性，因此可以通过驯化使细菌逐步适应外界环境(周峨, 2002)。驯化微生物是指将分离得到的微生物放到所需要处理的物质体系中生长(向丽君等, 2010)，同时进行分离筛选。该方法是在逐渐变化外界条件的情况下，对微生物进行转移培养，在培养过程中，那些对新环境不适应的微生物死亡了，而某些活力较强的微生物则会发生变异，演变成耐性更强的新的耐受性菌株存活下来。

在生物有机肥的生产过程中，加入的功能菌一般为芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌、固氮菌、解磷菌和光合细菌等(吴建峰和林先贵, 2002, 土壤, (2): 68-72; 刘健等, 2001)。

本研究以生物有机肥生产中常用的巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌为例，利用驯化微生物的原理对这3株菌进行耐盐诱导，使其经过高盐耐受性驯化后既能适应一定无机盐浓度的外界环境，又可以正常发挥其生理作用，提高作用效率。

1结果与分析
1.1尿素驯化的结果分析
3株菌接种如含盐培养基即时的OD₅₅₀值都比较低(OD₅₅₀<0.10)，如图1和图3也可以看出巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌在1%的尿素浓度下OD₅₅₀值分别为0.061和0.059，而图5所示，圆褐固氮菌在1%的尿素浓度下OD₅₅₀<0.05，因此以1%的尿素浓度作为驯化初始浓度(尿素浓度是指添加的尿素在100 ml液体培养基中的百分含量)，摇培48 h之后静止30 min测定菌悬液的OD₅₅₀值，并进行传代，待菌种在该盐浓度生长稳定后加大尿素的浓度，并测定各浓度下菌种的生长曲线，在驯化结束时测定菌种的活菌数。

1.1.1巨大芽孢杆菌的耐盐性研究

图1巨大芽孢杆菌的驯化过程 Figure 1 the domestication of Bacillus megaterium

图1、3、5分别表示了三株菌在不同尿素浓度下生长驯化情况，经过多次传代培养，巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌在尿素浓度为1%和3%时生长状况都非常好，菌种OD₅₅₀值也随着传代次数的增加不断增长，分别达到1%时的0.992、0.997和3%时的1.036、1.045。浓度升高到6%时两株菌的生长状况都明显下降，最高OD₅₅₀值仅为0.091和0.070将尿素浓度调整到5%时，两株菌又都恢复了良好的生长状况，最大的OD₅₅₀值分别达到0.521、0.587，因此巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌能耐受的最高尿素浓度为5%，在6%的浓度下OD₅₅₀<0.05。

图2巨大芽孢杆菌的生长曲线 Figure 2 the growth curve of Bacillus megaterium

1.1.2胶冻样芽孢杆菌的耐盐性研究

图3 胶冻样芽孢杆菌的驯化过程 Figure 3 the domestication of Bacillus mucilaginosus

图4 胶冻样芽孢杆菌的生长曲线 Figure 4 the growth curve of Bacillus mucilaginosus

1.1.3圆褐固氮菌的耐盐性研究

图5 圆褐固氮菌的驯化过程 Figure 5 the domestication of Azotobacter chroococcum

图6圆褐固氮菌的生长曲线 Figure 6 the growth curve of Azotobacter chroococcum

圆褐固氮菌在各浓度的生长情况都不是很好，经过若干次传代后其OD₅₅₀值变化不大并且不稳定，在尿素浓度为3%的条件下几乎不见生长，将浓度降低到2%时见少量生长，此时的OD₅₅₀值仅为0.109。所以圆褐固氮菌能够耐受的尿素的极限浓度仅为2%。

由三株菌的生长曲线图可以看出在尿素的耐受性培养过程的中，三株菌的生长曲线(图2, 4和6)并没有发生显著的变化，并且对数生长期也符合在伯杰氏手册上查得的时间范围(Garrity, 1994)，巨大芽孢杆菌的对数生长期在4 h~16 h，胶冻样芽孢杆菌为4 h~25 h，圆褐固氮菌则为7 h~19 h，因此也为菌种培养过程中提供了一个确定的更有效的传代时间。

1.1.4活菌计数
由下表1可以看出三株菌在每一浓度耐受试验结束时的活菌数量，与培养过程中菌株的OD₅₅₀值表示了同样的趋势，随着浓度的增加，活菌数逐渐减少，圆褐固氮菌更明显，其在2%时已经降低到0.96×10⁶ cfu/ml，已经达到了能够耐受尿素浓度的极限，而巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌均可以达到5%的尿素耐受浓度，并且活菌数量分别为1.06×10⁸ cfu/ml和0.97×10⁸ cfu/ml，分别将在此浓度下生长良好的菌株保存备用。

表1有效活菌数 Table 1 Living bacteria count

 
1.2总的盐浓度驯化结果分析
对以上尿素耐受性驯化得到的菌种在驯化培养基内培养至对数生长期，平板划线分离出单个菌株，进行下一步过磷酸钙和硫酸钾的耐受性试验。本实验采取的方式是，向含有菌种耐受极限尿素浓度的培养液中添加等质量比(1:1)的过磷酸钙和硫酸钾，接种驯化后的菌株，并逐渐提高过磷酸钙和硫酸钾的浓度，分别进行单个菌种和混合菌种的培养，每个梯度培养后含盐培养基划线分离出耐受该浓度的单个菌落，通过液体富集培养后，加入下一个浓度的培养，直至菌液所含无机盐浓度达到8%。最后将单个培养最终得到的耐盐菌株按照1:1:1的比例接种到混合培养基中进行混合培养驯化，实验设置见表2。
 

表2培养基中无机盐含量 Table 2 Content of inorganic salts in the culture

1.2.1不同无机盐浓度各菌的生长曲线
 

图7巨大芽孢杆菌生长曲线 Figure 7 the growth curve of Bacillus megaterium

图8 胶冻样芽孢杆菌生长曲线 Figure 8 the growth curve of Bacillus mucilaginosus

 

图9圆褐固氮菌生长曲线 Figure 9 the growth curve of Azotobacter chroococcum

由以上的三幅生长曲线图可以看出在尿素、过磷酸钙、硫酸钾的诱导驯化培养过程中巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌的生长曲线的对数生长期有所改变，分别由原来的4 h-16 h和4 h-25 h 变为7 h-20 h和15 h-27 h，圆褐固氮菌的生长曲线未见明显改变，说明盐的胁迫在一定程度上影响了微生物的生命活动。另外随着无机盐浓度的增加，菌种的OD₅₅₀值逐渐减少，巨大芽孢杆菌的OD₅₅₀在8%的浓度下出现明显的下降，最高只达到0.881，而胶冻样芽孢杆菌在7%浓度时已经有所下降，8%的浓度与7%时没有明显的改变， OD₅₅₀值分别为：0.467、0.460。圆褐固氮菌耐受的无机盐浓度依然很低，在4%的浓度下已经有所下降，将在相应极限浓度下的菌液划线分离出单个菌株，保存备用。

1.2.2活菌计数
分别将不同浓度生长稳定的菌种梯度稀释后用含盐培养基平板计数，计算活菌数量。

另外将保存的三株经总无机盐驯化后菌株按照1:1:1比例接种到混合培养基中进行混合培养，调节培养基的无机盐浓度为8%，利用酸碱调节pH为7.0，通过测定培养基的OD₅₅₀值检测混合菌的生长情况，24 h传代一次，直到菌体生长的OD₅₅₀值为1.000，系列稀释后分别用含盐培养基平板分离出三种菌，测定活菌数量。

表3三株菌在总无机盐浓度下的活菌数 Table 3 the living bacteria count under different salt content

 由上表3可以看出，3株菌在混合培养的条件下比单独培养时活菌数量都有不同程度的增加，并且所能耐受的无机盐浓度也有了相应的提高。单独培养时，巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌及圆褐固氮菌耐受总无机盐的浓度分别为：7%、7%和4%。而混合培养后的耐受浓度均达到了8%并且OD₅₅₀值较稳定，特别是圆褐固氮菌在混合培养时，8%的无机盐浓度下活菌量达到了0.46×10⁸ cfu/ml，远远高于单独培养时4%无机盐浓度下的8.71×10⁵ cfu/ml，可能是由于其他两株菌的存在消耗了一定浓度的无机盐使得圆褐固氮菌的生存环境有所改善，另外，巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌在混合培养的条件下，活菌数量也分别有了不同程度的提高，分别由1.34×10⁷ cfu/ml和6.51×10⁷ cfu/ml，提高到1.90×10⁸ cfu/ml和1.05×10⁸ cfu/ml。说明混合培养下3株菌的生存条件比单独培养时盐的胁迫减小，并且3株菌混合培养时生长状况良好，未存在明显的拮抗作用。

2讨论
2.1 3株菌对尿素的耐受性
3株菌对于尿素的耐受能力各有不同，圆褐固氮菌起始的耐受能力非常低，在1%尿素浓度的培养基内几乎不见生长，而到驯化结束时可以耐受2%的极限浓度，此时活菌数为0.96×10⁶ cfu/ml，巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌耐受尿素的浓度达5%，活菌数分别为1.06×10⁸ cfu/ml和0.97×10⁷ cfu/ml，可能是由于少数的细胞在环境胁迫下发生了变异，产生了与耐盐性能密切相关的基因突变(张晓昱等, 2002)，也可能是在高盐的胁迫下细胞启动了另一套调节机制来适应盐胁迫的环境。

2.2三株菌对总无机盐浓度的耐受性
在耐受尿素、过磷酸钙、硫酸钾的实验中，三株菌混合培养比单独培养得到了更好的耐受效果，圆褐固氮菌单独培养时耐受总无机盐的浓度仅达到4%，而混合培养后圆褐固氮菌耐受浓度达到8%，并且活菌数达到0.46×10⁸ cfu/ml，巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌的活菌数量分别达到：1.90×10⁸ cfu/ml和1.05×10⁸ cfu/ml.。可能的原因是，混合培养时另外两株菌的自身代谢活动为圆褐固氮菌提供了一个比单独培养时更为合适的生长条件，使其单独承受的盐胁迫作用下降，因此达到了较高的无机盐耐受浓度，也可能是因为三株菌产生了共生机制来适应不利的生长环境。因此，不同菌株对于盐胁迫在不同的培养条件下具有不同的生长调节机制，有待于进一步深入研究。

3材料与方法
3.1供试菌种
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium de Bary)，菌种编号 ACCC 10011　
胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，菌种编号ACCC 10013
圆褐固氮菌 (Azotobacter chroococcum Beijerinck)，菌种编号ACCC 10006　
以上菌株均由中国农业科学院菌种保藏中心提供。

3.2供试无机盐
尿素、过磷酸钙、硫酸钾，均购自北京某化肥厂。

3.3实验方法
本研究采用渐次提高培养基中无机盐(尿素、过磷酸钙、硫酸钾)浓度的方式(李慧和王异静, 2006)，用已经活化培养且生长良好的菌种做菌源，挑取单个菌落接种到装有100 mL含盐培养基的锥形瓶中，在温度为28~30℃、200 r/min的摇床上振荡培养24 h (沈齐英等, 2005, 环境科学与技术, 28(2): 35-37)。每隔2~3 h测定OD₅₅₀值，以观察菌种在含盐培养基上的生长状况(徐新阳和谷妮娜, 2007)。48 h后用含盐培养基平板分离出存活的菌株，再将其制成悬液，取分离样品1 mL接种于富集培养基中继续培养，48 h后再取菌液1 mL进行传代培养。每隔48 h接种传代1次。经过若干次高盐培养之后，采用含盐培养基分离得到单个菌落，进行扩大培养，得到需要的菌种(尹利端, 2005)，选择生长代谢旺盛的菌种保存在4℃备用。

研究表明，氮对微生物的杀伤力较大(王法云等, 2009)，添加6%、9%的总氮对肥料活菌总数有显著不良影响(江丽华等, 2004)，因此本实验设计5%的尿素并在微生物耐受尿素的基础上设计8%的总盐分，不断增加培养基中无机盐百分比含量，使细菌逐渐适应一定的无机盐浓度直到其无法正常生长。

本实验按照两个步骤进行，首先将微生物进行耐受尿素的培养，对存活并生长良好的菌株再继续进行CO(NH₂)₂、Ca(H₂PO₄)2•H₂O、K₂SO₄总无机盐的耐受性培养。具体无机盐的浓度见表4。 

表4 盐浓度水平 Table 4 the level of salt

3.4细菌基础培养基
(1) 巨大芽孢杆菌：马铃薯浸提液 500 ml，蔗糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 500 ml。
(马铃薯去皮1800 g，用细棉布将马铃薯包好，置于4500 ml水中，煮沸10分钟，弃去薯块，15磅压力20分钟灭菌，储冰箱备用)。(姜瑞波和张晓霞, 2005)
(2)胶冻样芽孢杆菌：蔗糖 10 g，酵母膏 0.4 g，K₂HPO₄ 0.5 g，CaCO₃ 1 g，MgSO₄7H₂O 0.2 g，FeCl₃ 0.005 g，蒸馏水 1000 ml，琼脂 20 g，pH 7.0~7.2。(姜瑞波和张晓霞, 2005)
(3)圆褐固氮菌：蔗糖或甘露醇 10 g, K₂HPO₄ 0.5 g，NaCl 0.2 g，CaCO₃ 1 g，MgSO₄7H₂O 0.2 g，琼脂 15~20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0~7.2。(姜瑞波和张晓霞, 2005)
(4)混合培养基：马铃薯浸提液 200 ml，蔗糖 15 g，酵母膏 0.1 g，K₂HPO₄ 0.3 g，CaCO₃ 0.6 g，MgSO₄7H₂O 0.1 g，FeCl₃ 0.002 g，NaCl 0.06 g，琼脂 15~20 g，蒸馏水800 ml，pH7.0~7.2。
(5)含盐培养基：在原培养基的基础上添加一定百分比浓度的无机盐。

3.5测定指标
菌种的OD₅₅₀值，根据比浊法原理，在722分光光度计上进行测定驯化培养基中菌种的浓度，某一波长的光线，通过浑浊液体后，其光强度将被减弱。根据朗伯-比尔定律(赵斌和何绍江, 2002)。
 
若样品层度b一定，则A值与样品的浊度相关，根据此原理，可以通过测定样品中的A值来代表培养基中菌种的数量。

生长曲线
在适宜的液体培养基中将少量单细胞微生物接入，并在适宜条件下进行培养，通过定时取样测定细胞数量，发现微生物的生长速度随时间有规律的变化，以培养时间为横坐标，以菌量的对数值或生长速度为纵坐标作图，可获得微生物的生长曲线(赵斌和何绍江, 2002)。

活菌计数
将待测样品一系列10倍稀释，然后选择三个稀释浓度的菌液，分别取0.2 ml加到制备好的平板上，然后用灭菌的涂棒将菌液涂布平板，放入适宜温度下培养，计算菌落数。按下面公式计算出原菌液的含菌数。

每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5 (赵斌和何绍江, 2002)。

作者贡献
本文第一作者为本研究的主要完成人；第二作者辅助完成主要的实验研究，特别在菌种生长曲线测定方面做了主要的工作；第三作者在实验的布置、实施过程中给予了本文作者很多帮助；第四作者为本文的通讯作者，在研究的构思及实施过程中给予了认真的指导与帮助。

致谢
本研究由国家十一五科技支撑(2006BAD07A13-1-1)北京市生态重点学科(XK10019440)共同资助。感谢导师孙振钧教授的悉心指导和严谨的治学态度使得实验能够顺利进行，感谢王冲老师在本文研究及撰写过程中给予的宝贵意见，感谢廖燕同学在实验过程中的大力支持。

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