青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.)在分类学上属于禾本科(Poaceae)、大麦属(Hordeum)、多棱裸粒大麦变种。在藏族地区称为青稞，在其它地区称为裸大麦、米大麦、元麦等。青稞与皮大麦最大的区别在于成熟后，青稞的籽壳与颖果易分离，而皮大麦的籽壳与颖果不易分离。

青稞一般具有食用、饲用、酿酒等用途。青稞炒面，俗称糌粑，是藏族人民的主食。青稞也是一种很好的饲料作物，营养丰富、饲喂品质好，使它在谷物饲料中的地位仅次于玉米。另外，以青稞为原料酿造而成的青稞酒也具有悠久的历史。近年来，随着人们生活水平的提高以及对健康的日益关注，青稞也被加工成保健品进入市场(江春艳等, 2010, 西藏科技, 203(2): 14-16)。

青稞在中国主要分布于青藏高原地区，包括西藏、青海、甘肃、云南和四川这5个省的全部或部分地区。前人对中国青稞种质资源的研究主要集中在西藏、青海及四川地区。Zeng等(2002)用RAPD标记分析了23份西藏大麦品种，用5对引物扩增出44条多态性带，表明这些大麦品种存在着丰富的遗传变异。Feng等(2006)用35对SSR引物研究了来自西藏、青海和四川这3个省的65份青稞当地品种，结果表明西藏青稞显示了最高的多样性。潘志芬等(2007)用淀粉粒蛋白组成评估了青藏高原栽培青稞的遗传多样性，结果表明西藏地区青稞的遗传多样性很丰富。杨平等(2008)利用SRAP标记对25份来自四川的青稞育成品种进行了遗传多样性分析，结果显示这些青稞遗传基础较为狭窄。段瑞君等(2010)测定了青海省主要种植的青稞品种的染色体核型，结果表明这这些品种在核型存在一定分化。仅张建华等(2009)对云南各个地区青稞的品种亲缘关系做了SSR分析，其中包括云南西北部迪庆州的少部分青稞品种。

在云南，青稞主要分布于迪庆藏族自治州。冬青稞主要分布于2 800 m以下地区，2 800 m以上地区为春青稞。青稞在全州的种植面积在60年代为5~6万亩，亩产为180 km左右。迪庆青稞品种都是本地古老的品种，1970年以后，曾引进西藏、青海、四川和甘肃的品种，因不适宜，已被淘汰。迪庆州青稞主栽品种有：四棱型的中甸长芒黑青稞、德钦红青稞、短芒黑青稞和八十天青稞；六棱型的短芒白青稞、黄青稞等(勒安旺堆, 2003)。

目前，关于云南迪庆州青稞种质资源的遗传多样性与遗传关系的研究极为稀少，而这些研究是制定生物多样性保护和提供育种资料的前提。本研究利用SSR分子标记手段研究迪庆州青稞种质资源，旨在为迪庆州青稞当地品种的保护以及青稞的育种提供资料。

1结果与分析

在64份青稞当地品种组成的群体中，大麦7条染色体所选取的48对SSR引物有8对引物无法扩增出条带，21对扩增出的条带无多态性，19对扩增出了多态性条带。这19个微卫星位点分布于大麦的6条染色体中(第6号染色体上的引物没有扩增出多态性条带)，集中分布在1、2、3和4号染色体上，5和7号染色体上位点较少(表1)。19对引物扩增出的等位基因从2个(Bmag0105, , Bmag0692, Bmag0140, Bmac0209, Bmag0136, EBmac0701, EBmac0679和Bmag0223)到10个(Bmac0032)不等。其中扩增出2条多态性带的有8个引物，占42%；扩增出3条多态性带的引物有5个，占为26%；扩增出4条多态性带的引物有2个，占11%；扩增出5、7、9和10条多态性带的引物数目均为1，都占5%。19对引物共扩增出70个等位基因，平均每对引物扩增出3.68个。19对引物的PIC值从0.03 (Bmag0105，Bmag0136)到0.87 (如HVM33, 图1)不等，平均值为0.30 (表2)。其中，PIC值在0.2以下的有11对引物，占57.9%；0.2~0.4的有3对引物，占15.8%；没有引物的PIC值在0.4~0.6之间；0.6~0.8的有3对，占15.8%；0.8~1.0之间的有2对引物，占10.5%。64个青稞样品群体的He值为0.153 3。

表1 48对引物信息

图1引物HVM33的扩增产物多态性

表2 19对引物的等位基因数及PIC值

 

所有64份青稞当地样品之间的遗传相似系数从0.102 6 (d11与s12)到1.000 0不等(d8与d10, d13与d14, d22与d24, d23与d25)，平均值为0.696 7。64份当地样品与N1品种(品引1号)的遗传相似系数为0.307 7到0.894 7，平均值为0.725 3；与N2品种(品引4号)的遗传相似系数为0.359 0到0.894 7，平均值为0.743 8；与N3品种(品引5号)的遗传相似系数为0.307 7到1.000 0，平均值为0.723 7；与N4品种(99-7)的遗传相似系数为0.307 7到0.842 1，平均值为0.713 0。4种育成品种与64份当地样品的遗传相似系数平均值从小到大排列为99-7<品引5号<品引1号<品引4号。与N1、N2和N3品种的遗传相似系数值低于0.5的样品均有2个(均为d21, w1)，在64份样品中都占3.1%；与N4的遗传相似系数值低于0.5的样品有3个(s12, d21和w1)，占4.7%。

用UPGMA分析的68份青稞材料的聚类结果如图2所示。在遗传相似系数为0.632处，材料被分为4支。第Ⅰ支包括60份材料，其中来自香格里拉县的有26份材料，占60份材料的43.3%；来自德钦的有23份材料，占38.3%；来自维西的有7份材料，占11.2%；4份育成品种全部归在此类，占6.7%。第Ⅰ支中包括四棱青稞32份，占53.3%；六棱青稞28份，占46.7%。包括春播青稞50份，占83.3%；冬播青稞10份，占16.7%。第Ⅱ支只含有d11这一份材料。第Ⅲ支包括5份材料，全部来自香格里拉县(s5, s6, s7, s9和s12)。四棱青稞有3份，占60%；六棱青稞2份，占40%。5份材料全部为春播。第Ⅳ支包括2份材料，一份为来自德钦县的d21，另一份为来自维西县的w1。两份材料均为四棱。一份为春播，一份为冬播。

图2 68份青稞材料的聚类图

本实验从大麦7条染色体上挑选了48对SSR引物，但仅有19对扩增出来了多态性产物。未扩增出多态性产物的29对引物中，有少数引物(8对)无法扩增出PCR产物。在做了PCR反应体系的梯度(调节模板, Mg²⁺, 引物浓度和退火温度等)后，依旧无法扩增出条带。本实验所用引物是由Ramsay等(2000)以欧洲、加拿大等国外大麦品种的DNA开发的，而这些大麦在亲缘关系上与地处青藏高原的青稞是比较远的，因此少数引物不具有通用性也属于正常。但是大多数(40对)的引物可以正常扩增出PCR产物，这说明SSR标记的通用性是非常好的。

2.2迪庆藏族自治州青稞遗传多样性与当地环境、文化的关系

多态性一般是从丰度(richness)和匀度(evenness)两方面来衡量。丰度表示的是多态性的数目，一般用计数的方式表示；而匀度表示的是多态性的在群体中的分布情况，一般用公式1–ΣPi2来表示，其中Pi是指第i种类型所占的频率。多态性与丰度和匀度都成正比关系。在SSR分子标记技术中，染色体上单个微卫星位点多态性评价中，丰度用等位基因数目来衡量，而匀度是用PIC值来表示的，它也同时评价了引物的有效性。

本实验中，在64份当地青稞样品组成的群体中，19对引物扩增出的等位基因从2~10不等，平均每对引物3.68个。19对引物中有超过三分之一(37%)的引物扩增的等位基因数等于或大于4个，最多为10个。从丰度上来说迪庆州的青稞遗传多样性是较为丰富的。PIC值从0.03~0.87不等，均值为0.30。PIC值超过0.2的引物有8对，占19对引物的42.1%。所以，从匀度来看，迪庆州的青稞遗传多样性也较丰富。

另外，64份青稞的遗传相似系数从0.102 6到1.000 0之间，跨度是非常大的。这些都说明了，迪庆州当地青稞的遗传多样性较为丰富的。

迪庆州位于青藏高原东南部，海拔从1 480 m到6 740 m。而不同的海拔则代表了不同的地貌、温度、光照强度、土壤类型等，从而形成了垂直气候分布。本研究中青稞的取样地点海拔从1 749 m到3 600 m。在2 200 m以下多为河谷地貌；2 200 m至2 800 m多为山地地貌；2 800~3 600 m为高原地貌。其中，河谷地貌最具地域特色，可分为三种类型。燥热河谷，夏长冬短，气候燥热；干热河谷，夏短春秋长，温暖宜人；湿热河谷，四季分明，炎热湿闷。采集地土壤类型海拔从低到高依次为红壤(2 600 m以下)、黄壤(2 600 m以下)、黄棕壤(2 600~2 900 m)、棕壤(2 900~3 300 m)以及暗棕壤(3 200~3 700 m)。气候类型分为南温带(2 300 m以下)，属于低温层，年平均气温为17~11.2℃；暖温带(2 300~2 800 m)，属中温层，平均气温11.2~10℃；北温带(2 800~4 200 m)，属高寒层，平均气温10~5℃。Wang等(2009)研究了西藏野生大麦的遗传多样性，结果显示，地理环境越复杂，遗传多样性越丰富。于智勇和丁毅(2007, 武汉大学学报(理学版), 53(2): 231-238)也发现大麦的遗传多样性与环境有着紧密的联系。Hedrick等(1976)，Spieth (1979)亦指出在复杂的环境是形成丰富的遗传多样性的基础。因此，迪庆藏族自治州的当地青稞遗传多样性的丰富与其复杂的环境是分不开的。

一般来说，农村的当地居民对本地的植物和动物资源积累有很多的知识。许多研究都指出，当地居民的地域文化以及耕作模式都对农作物资源起到了保护作用(Altieri and Merrick, 1987; Plucknett et al., 1983; Pei and Xu, 1997)。民族植物学的研究亦指出，收集当地农民利用生物多样性传统知识，是评价当地生物多样性的一种很有价值的手段。农村地区的药材资源、饮食、自然崇拜、生活习惯、农业方式等的价值在过去的二十年来中正越来被认可(Walker et al., 1995)。在迪庆藏族自治州，主要的居民为藏族，而藏族的传统文化对自然资源的管理及保护起了很重要的作用。作为当地藏族居民最重要的主食，青稞种质资源在当地传统农作方式下得到了保护。首先，青稞在当地一般被种植于山地或丘陵地区贫瘠的土地上。不同的当地品种被保留了下来去适应多变的生境。其次，当地居民一般将2~3种青稞当地品种混栽在一片田地里。朱有勇等证明水稻混栽能够对病虫害的防治起到积极的作用(Zhu et al., 2000)。因此当地居民这种无意识的行为对病虫害的防治起到一定的作用。另外，青稞在藏民的宗教活动、日常生活中有重要的作用。在藏族宗教祭祀活动中，青稞、小麦、水稻、玉米等作为贡品，以祈求来年大丰收。许多藏民祖祖辈辈都种植着他们的祖先种植过的青稞，以此作为对祖先的纪念。青稞在藏民的日常生活中不但被做成糌粑食用、用来制作青稞酒等，还用来喂牛、羊等牲口。青稞在当地藏族人民的宗教活动与日常生活中具有各种各样的用途，因此很多稀有青稞资源被保留了下来以满足不同的需求。

2.3青稞的遗传相似系数与聚类分析

68份青稞材料的聚类结果与材料来源、棱型和冬春性均无明显关系。这与潘志芬等(2007, 中山大学学报(自然科学版), 46(2): 82-86)、张建华等(2009)的研究结果均一致。

64份青稞品种与4份现代育成品种的遗传相似系数显示，大多数的青稞品种与4份育成青稞品种的遗传关系是相近的。而有8份材料与4份青稞育成品种在聚类图上未聚为一类，遗传关系较远。其中，来自德钦的d21与来自维西w1这2份材料与4种测试品种遗传关系最远。这些种质可为青稞的杂交育种提供材料。今后可对此8份材料的农艺性状(如抗病虫害特性、抗旱性、抗寒性和产量等)进行调查，看是否有可以利用的性状，为遗传育种提供更为全面的资料。

3材料与方法

共68份青稞材料，其中31份取于香格里拉县(编号: s1~s31)，25份取于德钦县(编号: d1~d25)，8份来自维西县(编号: w1~w8)，此64份材料为当地传统遗传资源。另外4份是迪庆引进不久的的现代育成品种，由香格里拉县小中甸镇农科所提供，在当地农户中已有种植。4份育成品种名称分别为品引1号(编号: N1)、品引4号(编号: N2)、品引5号(编号: N3)和99-7(编号: N4)。68份材料中，四棱青稞有37份，占54.4%；六棱青稞有31份，占45.6%；无二棱青稞。春播青稞有57份，占68份青稞材料的83.8%；冬播青稞有11份，占16.2%。采集地海拔从1 746 m至3 600 m (表3, 采集地见图3)。

 

表3 青稞样品信息

 

图3 64份青稞采集地点

3.2 DNA提取

用Doyle J.J.与Doyle J.L. (1987)提出的CTAB提取法提取大麦全基因组DNA。提取材料使用大麦种子萌发2周左右长出的新叶。每份材料取0.3 g进行DNA提取。

 

在大麦的7条染色体上共选取了48对引物进行PCR扩增(表1)。引物序列以及PCR反应条件设置来源于网站http://www.genetics.org/supplemental/ 156/4/1997/DC1 (Ramsay et al., 2000)。

 
反应总体系为15 µL。其中包括：1.5 µL的buffer，0.2 mmol/L的dNTP，2.5 pmol的正反向引物，1 U的Taq酶，1 µL的50 ng/µL的DNA。以上所需试剂均购自Tiangen公司。PCR产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳进行检测。使用50 bp梯度Marker (购自Fermentas公司)。

3.4数据分析

按照引物的序列信息中的目标片段大小(引物来源网站中size栏)以及Marker，在聚丙烯酰胺凝胶中确定出目标片段。读带时只读取目标片段。不同的等位基因用英文字母来表示，按照片段的大小由小到大依次标为A、B、C和D等。相同大小的等位基因用相同字母表示，大麦是二倍体作物，因此每个样本最后得到的是基因型数据，如AA、BB和AC等。用夏寒冰和卢宝荣(2009)发明的软件(01转换程序v1.2)将SSR共显性基因型数据转换为二元型数据(即0, 1式读带)。

使用POPGENE (Version 1.32)计算每个引物扩增的等位基因数及64份当地品种群体的Nei氏基因多样性指数He值(Nei, 1973)。

多态性信息含量PIC (polymorphism information content)是对SSR引物扩增结果多态性的重要评价指标。PIC值越高，表示此引物扩增的多态性条带的均匀度(evenness)越高，此引物在评价遗传多样性时越有效。在EXCEL中用如下公式PIC=1–ΣPi2计算所有引物的PIC值，其中Pi 表示某个引物第i个等位基因的频率(Smith et al., 2000)。

按照Dice (1945)的方法，用NTSYS-pc(Version 2.11C)计算所有68份样品的遗传相似系数(similarity coefficient)，并用非加权配对算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic average)对样品进行聚类分析。

作者贡献

郭钰是本研究的实验设计者与实验完成人，进行了数据分析以及论文的写作。李亚莉采集了大部分的材料。黄媛参与了实验设计与数据分析等工作。Devra Jarvis女士、Kazuhiro Sato、Kenji Kato和陈丽娟对论文写作提出了宝贵意见。龙春林是本研究的的构思者与负责人。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

感谢云南迪庆州小中甸农科所的工作人员在采集青稞材料时候所给予的帮助。感谢昆明植物所赵东伟在聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中的帮助。感谢昆明植物所乔鹏在数据分析软件方面给予的帮助。感谢匿名的同行评阅人给予的修改建议。

参考文献