盐胁迫是主要的非生物胁迫之一，世界耕地面积的20%和近一半的灌溉土地都受盐胁迫的影响(Flowers and Yeo, 1995)。中性盐(NaCl)和碱性盐(Na₂CO₃, NaHCO₃)对植物有两种不同的压力，分别为盐，碱胁迫(石德成和殷立娟, 1993; Yang et al., 2007)。中国东北地区的盐碱土壤中主要含有Na₂CO₃和NaHCO₃，土壤pH高达9，严重影响农业生产，是农业生产上面临的主要逆境胁迫(柳参奎等, 2004)。而培育耐盐碱转基因农作物是提高产量的有效途径之一。分子手段选育抗盐碱植物新品种是关键，从盐生植物中分离有抗盐碱功能的基因，为观赏植物，农作物等相关研究提供了丰富的耐盐碱基因。

弱碱盐NaHCO₃胁迫，不仅提供了高Na⁺，高pH，HCO₃^-也会影响植物生长发育，也是胁迫因素之一(柳参奎等, 2006, 东北林业大学出版社, pp.4)。KHCO₃作为胁迫研究抗逆相关基因的研究未见报道。

FOX hunting system (full-length cDNA over-expressing gene hunting system)是一种功能基因选择性筛选技术，能够系统说明植物基因功能。这种技术是通过将单个或几个全长cDNA转入模式植物中进行过量表达，能够产生大量显性突变，根据突变植株新的表型特征，最终鉴定转入基因的功能(Ichikawa, 2006)。

碱茅(Puccinellia tenuifolra)是禾本科碱茅属多年生草本，多分布于我国东北部平原盐碱地，是土壤盐碱含量较高地区建植草坪的理想草种(Zhang et al., 2011)。本研究利用实验室已经构建好的碱茅cDNA文库转入酵母菌株(Wang et al., 2011)，得到碱茅cDNA酵母文库。利用KHCO₃进行非生物胁迫处理，通过FOX hunting system功能基因筛选技术，通过看其表型筛选抗HCO₃^-的抗性基因，为进一步挖掘和探索抗盐相关基因打下良好基础。

1结果与分析
1.1 KHCO₃胁迫筛选酵母菌株的分类
对KHCO₃筛选出的27个抗逆性克隆测序后，在NCBI网站进行分析并查阅文献，将这27个基因进行分类，包括渗透调节相关蛋白1个、与光合作用相关蛋白5个、运输蛋白1个，酶类6个、信号转导相关蛋白3个，辅助因子1个和未知功能蛋白10个(表1)。

表1 KHCO3筛出的27个基因测序分类

1.2 KHCO₃胁迫筛选酵母菌株的抗性分析
在含Aureobasidin A的YPD培养基上，转入空载pAUR101的酵母菌株和27个碱茅pAUR101-cDNA酵母菌株的长势基本一致。在含32 mmol/L KHCO₃的YP-U (Aureobasidin A)培养基中，可以观察到由于KHCO₃的盐胁迫作用，转入pAUR101空载的酵母菌株的生长受到抑制，长势弱于碱茅pAUR101-cDNAs酵母菌株。27个pAUR101-cDNAs酵母菌株生长情况在不同程度上有所差异。图1现象表明，27个酵母菌在32 mmol/L KHCO₃胁迫下具有耐受能力。其中含有Put22和Put27基因的菌株抗KHCO₃能力最强，其次为含Put6、Put11和Put15~Put26基因的菌株抗性较强，其余酵母菌株长势稍强于对照菌株。

图1 转入空载pAUR101的酵母菌株(CK)和27个碱茅pAUR101- cDNAs酵母菌株在含不同浓度KHCO3的YP-U培养基上的抗性分析

1.3部分基因的抗性验证
从筛出的27个抗逆性pAUR101-cDNAs酵母菌株中分别选出一个含未知基因Put22，一个含衰老相关蛋白同源性较高的Put17基因和含海藻糖六磷酸合成酶同源的Put27基因的3个菌株，为了进一步了解3个基因的抗HCO₃^-能力，对这3个酵母菌株进行不同浓度NaHCO₃胁迫下的抗性分析。

由图2看出，在YPD对照板上pAUR101 (CK)菌株和pAUR101-Put17菌株的生长状态基本一致，pAUR101-Put17在34 mmol/L NaHCO₃培养基上长势稍好于pAUR101 (CK)菌株，说明Put17基因对34 mmol/L NaHCO₃有一定抗性。
 

图2 pAUR101 (CK)和pAUR 101-Put17酵母菌株在NaHCO3胁迫下的抗性分析

从图3看出，pAUR101 (CK)和pAUR101-Put22在不加任何抗性的YPD培养基中长势基本一致，而pAUR101 (CK)酵母菌株在34 mmol/L NaHCO₃上长势明显减弱，在37 mmol/L NaHCO₃上生长完全受到抑制，而pAUR101-Put22酵母菌株的长势明显强于pAUR101 (CK)。结果说明Put22基因对37 mmol/L NaHCO₃有较强耐受性，与KHCO₃胁迫表现出的抗性结果一致。
 

图3 pAUR101 (CK)和pAUR101-Put22酵母菌株在NaHCO3胁迫下的抗性分析

由图4可以看出，在YPD对照板上pAUR101 (CK)菌株和pAUR101-Put27菌株的生长状态基本一致，在不同浓度梯度的NaHCO₃胁迫中，pAUR101-Put27的表达使其宿主菌长势良好；结果表明Put27基因对37 mmol/L NaHCO₃有较强耐受性，与KHCO₃胁迫表现出的抗性结果一致。

图4 pAUR101 (CK)和pAUR101-Put27酵母菌株在NaHCO3胁迫下的抗性分析

2讨论
渗透调节相关基因Put27基因和大麦、小麦中的海藻糖糖六磷酸合成酶TPS同源性较高(XP002527520)，TPS能够积累海藻糖，而体内海藻糖的积累能提高植物的抗逆能力(Romero et al., 1997)，对干旱的耐受能力也很强，同时也影响植物的生长发育(Karim et al., 2007)。图1中KHCO₃胁迫分析表明Put27基因对KHCO₃胁迫表现出很强的抗性，目前此基因对HCO₃^-胁迫相关研究暂无报道，还需进一步研究。

光合相关蛋白中Put11基因和补光叶绿素a/b结合蛋白(ABO10493)同源性较高，在类囊体膜中除了进行光能吸收和传递之外，在维持类囊体膜的结构，调节激发能，在两个光系统之间的分配，光保护和对各种环境的适应等过程中都起着非常重要作用(Bassi, 1990; Bassi, 1997; Romero, 1997)。图1表明该基因在KHCO₃胁迫中表现出较强的抗性；Put8基因和核酮糖二磷酸羧化酶(NP001104921)的同源性较高，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶是植物光合作用过程中固定CO₂的关键酶，同样也参与植物的光呼吸代谢途径，消耗植物光合作用合成的有机物(Ashida et al., 2005)。

F-box类蛋白可以通过SCF (skp1p-cullin-F-box protein)复合体或者非SCF复合体形式调控多种细胞过程，包括转录调控、信号转换和细胞周期转换等(Kuroda et al., 2002)。Put6，Put11基因比对后发现与F-box有同源性(NP001151035, EU969259)，抗性分析表明对KHCO₃有一定抗性。

Q9XFB6被推测为烟酰胺合成酶基因，是一种金属螯合剂，对于缺铁胁迫应答反应起重要作用(Kim et al., 2005)。它的催化产物烟酰胺(NA)是铁及其它二价金属离子在体内吸收和转运的重要载体，且能与Fe²⁺结合形成Fe²⁺-Na复合物，从而使植物在酸性土壤中免受铁毒害(Douchkov et al., 2005)。

经KHCO₃胁迫筛选出的27个基因中有的与抗旱和抗盐胁迫相关，有的与氧化胁迫相关，有的与金属离子胁迫相关，但并没有发现与HCO₃^-直接作用的基因，推测可能会有间接的作用，对这些基因的耐盐机制还有待进一步研究。

Put17，Put22和Put27这3个基因对37 mmol/L NaHCO3均表现出较强的抗性，和Put22，Put27相比，Put17抗性相对较弱，有耐34 mmol/L NaHCO₃的能力。3个基因对KHCO₃，NaHCO₃都有较强抗性，可以推测出这3个基因的表达有可能是与HCO₃^-有关，也有可能与高pH有关。

3材料方法
3.1菌株和载体
酵母菌株INVScI (Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌JM109以及碱茅cDNA酵母文库由东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心提供。

穿梭型酵母表达载体pAUR101和载体pMD18-T购自TaKaRa公司。

3.2培养基
YP-U培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%半乳糖。YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。LB培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5% NaCl。

3.3 KHCO₃筛选碱茅cDNA酵母文库
将碱茅全长cDNA基因文库(库容量为1.608 9×10⁶ 个克隆)连接到酵母穿梭型表达载体pAUR101上，转化到酵母INVScI菌株中，构建碱茅cDNA酵母文库(库容量为1.865×10⁶个克隆)。按照每板3 000~4 000个克隆计算，在含有不同浓度KHCO₃ (30 mmol/L, 32 mmol/L和37 mmol/L)的YP-U固体培养基上进行多次筛选，每个浓度做20个重复，基本含盖了全部碱茅cDNAs (以空白YP-U培养基为对照)。涂板后平板置于30℃的培养箱中倒置培养2~5 d。从高浓度到低浓度选取大约64个抗性克隆，通过在含有30 mmol/L KHCO₃的YP-U的固体培养基上划线培养，最终确定主要研究27个抗性菌株，提取其DNA，进行PCR检测，回收片段后连接到pMD18-T上鉴定并测序。

3.4筛选获得的酵母菌株的总结分类
将已经测序的27个碱茅cDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)上进行BLAST比对后，查阅文献总结分析。

3.5筛选获得的酵母菌株的抗性分析
分别挑取固体培养基上转入对照(空载体pAUR101)质粒和(pAUR101-cDNA)文库质粒的酵母INVScI菌株的单克隆接种于2 mL含AbA (Aureobasidin A) YPD的液体培养基中，30℃匀速振荡培养约12~16 h。使用分光光度计测量各菌液的OD₆₀₀的数值，并将所有菌株的菌液浓度调到OD₆₀₀≈0.6。用无菌的去离子水洗酵母菌体2~3次，然后加入YP液体培养基将菌液分别稀释5个浓度梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5。分别取5 μL稀释好的酵母菌液涂布于YPD固体培养基和含有不同浓度KHCO₃的YP-U固体培养基上，30℃培养2~5 d，观察并记录实验结果。

参考文献
Ashida H., Danchin A., and Yokota A., 2005, Was photosynthetic RuBisCO recruited by acquisitive evolution from RuBisCO like proteins involved in sulfur metabolism? Research in Microbiology, 156(5-6): 611-618 doi:10.1016/j.resmic.2005.01.014 PMid:15950120

Bassi R., Rigoni F., and Giacometti G.M., 1990, Chlorophyll binding proteins with antenna function higher plants and green algae, Photochemistry and Photobiology, 52(6): 1187-1206 doi:10.1111/j.1751-1097.1990.tb08457.x

Bassi R., Sandonà D., and Croce R., 1997, Novel aspects of chlorophyll a/b-binding proteins, Physiologia Plantarum, 100(4): 769-779 doi:10.1034/j.1399-3054.1997.1000404.x

Douchkov D., Gryczka C., Stephan U.W., Hell R., and Baumlein H., 2005, Ectopic expression of nicotianamine synthase genes results in improved iron accumulation and increased nickel tolerance in transgenic tobacco, Plant, Cell and Environment, 28(3): 365-374 doi:10.1111/j.1365-3040.2005.01273.x

Flowers T.J., and Yeo A.R., 1995, Breeding for salinity resistance in crop plants: Where next? Australian Journal of Plant Physiology, 22(6): 875-884doi:10.1071/PP9950875

Ichikawa T., Nakazawa M., Kawashima M., Iizumi H., Kuroda H., Kondou Y., Tsuhara Y., Suzuki K., Ishikawa A., Seki M., Fujita M., Motohashi R., Nagata N., Takagi T., Shinozaki K., and Matsui M., 2006, The FOX hunting system: An alternative gain-of-function gene hunting technique, The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology, 48(6): 974-985

Karim S., Aronsson H., Ericson H., Pirhonen M., Leyman B., Welin B., Mäntylä E., Palva E.T., Van Dijck P., and Holmström K.O., 2007, Improved drought tolerance without undesired side effects in transgenic plants producing trehalose, Plant Molecular Biology, 64(4): 371-386 doi:10.1007/s11103-007-9159-6 PMid:17453154

Kim S., Takahashi M., Higuchi K., Tsunoda K., Nakanishi H., Yoshimura E., Mori S., and Nishizawa N.K., 2005, Increased nicotianamine biosynthesis confers enhanced tolerance of high levels of metals, in particular nickel, to plants, Plant Cell Physiology, 46(11): 1809-1818 doi:10.1093/pcp/pci196 PMid:16143596

Kuroda H., Takahashi N., Shimada H., Seki M., Shinozaki K., and Matsui M., 2002, Classification and expression analysis of Arabidopsis F-box-containing protein genes, Plant Cell Physiology, 43(10): 1073-1085 doi:10.1093/pcp/pcf151 PMid:12407186

Liu S.K., Zhang X.X., and Cheng Y.X., 2004, Is the “plant intracellular pH regulation system” a tolerance mechanism adapting to environmental stress? Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 2(2): 179-186 (柳参奎, 张欣欣, 程玉祥, 2004, “植物细胞内pH调控系统”是适应环境逆境的一个耐性机制? 分子植物育种, 2(2): 179-186)

Romero C., Bellés J.M., Vayá J.L., Serrano R., and Culiáñez-Macià F.A., 1997, Expression of the yeast trehalose-6-phosphate synthase gene in transgenic tobacco plants: Pleiotropic phenotypes include drought tolerance, Planta, 201(3): 293-297 doi:10.1007/s004250050069 PMid:19343407

Shi D.C., and Yin L.J., 1993, Difference between salt (NaCl) and alkaline (Na₂CO₃) stresses on Puccinellia tenuiflora (Griseb.) Scribn. et Merr., Zhiwu Xuebao (Journal of Integrative Plant Biology) 35: 144-149 (石德成, 殷立娟, 1993, 盐(NaCl)与碱(Na2CO3)对星星草胁迫作用的差异, 植物学报, 35: 144-149)

Wang T., Han X., Zhao M.Q., Tetsuo T., and Liu S.K., 2011, Studies on construction of regeneration system and genetic transformation of Puccinellia chinampoensis, Bioscience Methods, 2: 5 doi:10.5376/bm.2011.02.0005

Yang C.W., Chong J.N., Li C.Y., Kim C.M., Shi D.C., and Wang D.L., 2007, Osmotic adjustment and ion balance traits of an alkali resistant halophyte Kochia sieversiana during adaptation to salt and alkali conditions, Plant and Soil, 294(1-2): 263-276 doi:10.1007/s11104-007-9251-3

Zhang M.H., Wang L.Y., Dong L.H., Sun B., Zhang X.X., Tetsuo T., and Liu S.K., 2011, Cloning and characterization of PutSTE24 gene from Puccinellia tenuifolra which expressed in response to abiotic stresses, Molecular Soil Biology, 2: 2 doi:10.5376/msb.2011.02.0002