丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，简称serpin)广泛存在于动物、植物及微生物体内，是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂，能调节生物体内许多重要的生命过程，如蛋白质折叠、血凝、补体激活、炎症反应、细胞迁移、细胞基质重建以及肿瘤抑制等(Irving et al., 2002)。根据蛋白结构及氨基酸序列的相似性，蛋白酶抑制剂一般被分为4类：天冬氨酸类蛋白酶抑制剂、半胱氨酸类蛋白酶抑制、非金属蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂(Izaguirre et al., 2009)。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂是最重要，也是研究最为广泛的蛋白酶抑制剂之一(Kantyka et al., 2011)。Fermi和Pernossi等人于1894年在人类血液中发现最早的丝氨酸类蛋白酶抑制剂(Wago,1919)，Shultze等人于1955年分离得到并命名为α1PI (Andreas et al., 1991; Lee et al., 2011)。Hunt和Dayhoff根据α1PI与卵清蛋白和ATⅢ的序列相似性从而证明了丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的存在(Andreas et al., 1994)。丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类具有多种功能的同源蛋白，该类蛋白酶抑制剂能与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的活性部位结合，抑制其蛋白水解活性或者阻止蛋白酶原生成蛋白酶，从而调节生物的生理活动，在血液凝集、纤溶、细胞程序性死亡和生长以及炎症反应等生理过程中发挥着重要作用(Meyer-Hoffert et al., 2010)。现已从动物、病毒、植物、细菌和古生菌中发现1 500多类丝氨酸蛋白酶抑制剂，该类抑制剂一般含有350～400个氨基酸残基，分子量约为40～100 kD (Law et al., 2006)。本文简要回顾了丝氨酸蛋白酶抑制剂分类的发展历程，对于其中研究较为普遍的Kunitz、Kazal和Bowman-Brik (BBI) 等类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了重点介绍。同时，对于丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白结构进行了阐述，并基于对其蛋白结构的认知对抑制剂与靶酶反应的机制进行了归纳与总结。并且，本文深入阐述了丝氨酸蛋白酶抑制剂的生理活性及功能，并对该类抑制剂在癌症和生物防治病虫害等热点领域的研究现状及前景进行了分析，希望能够增进人们对于丝氨酸蛋白酶抑制剂相关知识的了解，促进国内抑制剂研究的深入发展。

1丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类
在过去数十年中，对于丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究主要着眼于脊椎动物，根据其基因结构的不同和特征性氨基酸位点的差异，脊椎动物的丝氨酸蛋白酶抑制剂可明显分为6个亚家族(van Gent et al., 2003)。而人体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂可划分为9个亚家族A~I，其中，最大的两个家族是类α1AT家族和类卵清蛋白家族。据分析，在人类血液中，丝氨酸蛋白酶抑制剂约占总蛋白的2%，其中70%为α1AT (α-1-antitrypsin) (Simonet et al., 2002)。无脊椎动物体内发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂绝大部分是从昆虫的血淋巴中分离得到的，一般分为两个家族：低分子量蛋白(一般为Kunitz型抑制剂)和分子量接近45 kD左右的抑制剂蛋白(Kubiak et al., 2009)，例如Pham等(1996)人在蚕体内发现的小分子量蛋白酶抑制剂(属于Bombyx家族)，Boigegrain等(2000)在蝗虫体内发现的小分子蛋白酶抑制剂。

现在已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂已超过1 500种，分别存在于各种各样的生物中，根据其序列相似性、二硫键拓扑结构和反应位点的不同，Laskowski和Kato (1980)将丝氨酸蛋白酶抑制剂分为八个不同的超家族，2000年进一步分为17个蛋白家族(Otlewski et al, 1999; Krowarsch et al., 2003)。其中包括胰腺胰蛋白酶抑制剂(Kunitz)家族(如典型的牛胰胰蛋白酶抑制剂，Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor，简称BPTI)、胰腺分泌类胰蛋白酶抑制剂(Kazal)家族、链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(Streptomyces subtilisin inhibitor)家族、Bowman-Brik型抑制剂家族和大豆胰蛋白酶抑制剂(Kunitz)家族等(表1)。

表1部分丝氨酸蛋白酶抑制剂家族 Table 1 The part families of serine protease inhibitors

现在研究较多的是Kunitz家族，该类抑制剂来源非常广泛，绝大多数Kunitz抑制剂具有4个保守的半胱氨酸残基并形成两个二硫键，其二硫键结构为该家族的特征性保守结构。该类抑制剂家族的研究以抑肽酶BPTI的研究为代表。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂是较为保守的家族之一，它们与血凝、纤维蛋白溶解、胚胎发生、个体发育、炎症和免疫应答等有着密切关系。最初，Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂从牛胰岛素中获得，随着研究的深入，绝大多数Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂从动物中获得，从细菌、真菌及植物中得到的序列较少(Ganesan et al., 2010)。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂通常由一个或者多个重复保守的结构域组成，其结构域序列较为保守。另外，许多Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂通常有一段信号肽，位于N末端，其长度大约为20个氨基酸(Brik, 1985; Cerenius et al., 2010)。Bowman-Brik型抑制剂(BBI)首先由Bowman于1944年利用丙酮从大豆中分离出来的，分子量为6 000~10 000 Da，含有大量的半胱氨酸，该类抑制剂在单子叶和双子叶植物中含量丰富(Qi et al., 2005)。双子叶中的BBIs一般分子量约为8 kD且含有两个反应位点，单子叶植物中的BBIs有大约8 kD和16 kD两种不同大小的结构，前者具有一个反应位点(另一个位点丢失)，后者具有两个活性位点。在向日葵发现的胰蛋白酶抑制剂(SFTI-1)是已知的最小的BBI类抑制剂，仅含有14个氨基酸残基(Janciauskiene, 2001)。

2丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构
许多抑制剂都是单结构域蛋白，且单结构域仅含有一个结合蛋白的反应位点，Ascaris、ecotin、STI和SSI等家族都属于该结构；而在Antistasin、Bowman-Brik、BPTI和Kazal等家族中，蛋白结构中含有多个重复性的单结构域和多个蛋白结合位点，从而能够单独与多个蛋白酶同时反应(Roberts et al., 2004)。丝氨酸蛋白酶抑制剂一般为单一肽链蛋白质，各种蛋白酶抑制剂的同源性约为30%，疏水区同源性较高约为70%，因此丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸残基具有较强的保守性。丝氨酸蛋白酶抑制剂分子一般由350~400个氨基酸残基组成，较多的多达500个。丝氨酸蛋白酶抑制剂在X光下的晶体结构一般为球状蛋白并含有9个α-螺旋和3个β-折叠(Antalis and Lawrence, 2004)。在抑制剂表面、距离C端约20个残基处具有一个环状结构区RSL(Reactive site loop),该结构是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的标志性结构，该结构区中存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1，近C端与P1相邻的氨基酸为P1′。蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂结合后会裂解RSL结构，并形成一个酰基中间物，RSL被断开后将插入β-折叠中(图1)与蛋白酶活性位点结合并破坏蛋白酶的活性位点结构。抑制剂在此构象改变过程中将失去约37%的结构，同时还使得抑制剂抵抗热变性及化学变性的能力大大提高(Makhatadze et al., 1993)。RSL结构不仅是抑制剂蛋白构象变化的关键区域，而且是丝氨酸蛋白酶抑制剂核苷酸序列中进化最迅速的区域。根据RSL结构的不同，丝氨酸类蛋白酶抑制剂可以划分为天然抑制、未激活和潜在抑制以及无抑制活性等三种状态，通过裂解、聚合和氧化等作用改变蛋白构象从而控制抑制活性。在潜在活性和裂解构象中的RSL插入β-折叠形成一个新的β-strand (strand 4A) (Antalis and Lawrence, 2004)。

图1 丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI-1的三种构象 注: RSL标为红色, β-sheet标为黄色 Figure 1 Three conformations of PAI-1 Note: RSL is marked in red; β-sheet is marked in yellow

丝氨酸蛋白酶抑制剂依靠RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密不易解离的酶-抑制剂复合物。一旦RSL结构插入其他区域或者发生缺失将导致抑制剂-靶酶结合不稳定，从而影响丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性。丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制专一性一般由P1决定，且与被抑制物的酶的特异性切点一致。丝氨酸蛋白酶抑制剂中一般都形成特殊的结构，比如环状肽段，多条二硫键等等，这些特殊结构氨基酸残基保守性很强，推测与蛋白酶的抑制活性有着密切关系(Cho et al., 2005)。例如植物来源的Bowan-Birk型蛋白酶抑制剂的结构中都存在一种由9个氨基酸形成的环状肽段，此结合环与蛋白酶的抑制活性有着密切的关系。人类血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂的病理学突变显示RSL必须保持相对可动性，才能完成抑制功能，如将抗凝血酶和CI-抑制子P12或P10Ala变为Thr、Ser或Pro，会造成活力全部或部分丧失。比较Serpin族氨基酸序列发现几乎所有的抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂在P14位均是小分子氨基酸，小分子氨基酸具有很大的柔韧性，使得抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂的RSL结构更加容易变化。

各个丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的结构都不相同，BPTI、Kazal、potato 1/2、SSI和STI等家族一般都含有典型的二级结构和疏水核心，该类抑制剂结构相对比较稳定，其变性温度较高，且能抵抗较高浓度的化学变性剂，例如中性PH下，BPTI的变性温度为100 ℃，在6 mmol/L的氯化胍溶液中不变性(Laskowski and Kato, 1980)。Sqush、Boowman-Brik、Grasshopper、Hirustasin和Ascaris等家族中含有多种连接的二硫键，该类二硫键是抑制剂结构稳定性的决定因素(Kojima et al., 1991)，但因缺乏二级结构和疏水结构，其变性温度一般都较低。

3丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用机制
蛋白酶抑制剂一般依靠表面突出的结构如一个单环或蛋白末端来阻碍靶酶活性位点结合来达到抑制靶酶活性的作用。根据抑制剂构象及抑制反应类型的不同，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以分为三种不同的反应机制：标准反应机制、非标准反应机制和普通反应机制(Law et al., 2006)。其中，标准反应机制是由Laskowski和Kato于1980年提出，属于该反应机制的抑制剂分子量较小，一般含有14到200个氨基酸残基，该类抑制剂数量最多(Laskowski and Kato, 1980)，在植物种子、鸟蛋和多种体液中较富集。该类抑制蛋白表面的RSL结构都极为相似，且与靶酶结合后其结构相似度更高。该环一般含有P₃至P₃’位点，环中心部位的P₁-P₁’蛋白键为抑制剂的反应位点，不同家族的P₁位点可能含有除Trp、Ile和Cys的任何氨基酸残基(Janciauskiene, 2001)。蛋白酶结合环与靶酶的活性位点高度互补，能够与靶酶的活性位点直接紧密结合，在结合过程中无共价作用，发挥作用的主要是范德华力和氢键，无构象变化(与酶原反应除外)，例如BPTI(牛胰蛋白酶抑制剂)和OMTKY3(火鸡卵类粘蛋白第三结构域) (Clementea and Domoney, 2006)。

普通反应类抑制剂也具有一个蛋白酶结合环，与标准机制抑制剂的环结构极为相似，不过该结合环较标准机制要长，约17个氨基酸残基。在反应过程中，抑制剂蛋白结合环中的P₁-P₁’蛋白键裂解，导致抑制剂发生巨大的构象变化，抑制剂和靶酶形成非常稳定的酰基-酶结合物，该结合属于非可逆共价地紧密稳定结合(图2)。该反应机制适用于分子量较大的抑制剂,典型的多达350-500个氨基酸残基(Qi et al., 2005)。

非标准机制类抑制剂通过其N端与靶酶活性位点结合从而抑制靶酶活性，另外与靶酶的非活性位点区域还有一个反应部位，该反应部位可以增强抑制反应的速度及特异性。该类抑制剂数量较少，一般存在于吸血类生物中用于抑制蛋白酶(如凝血酶和X_a因子)的血液凝集作用，较典型的是水蛭素和抗凝肽(Kim et al., 2009; Stepek et al., 2010)。

图2 抑制剂-蛋白酶结合物范例 注: A: 标准机制，笋瓜胰蛋白酶抑制剂(CMTI)和胰蛋白酶; B: 非标准机制, Ornithodorin和凝血酶; C: α1AT和胰蛋白酶. 图中, β-折叠标为蓝色, α-螺旋标为绿色; 其中CMTI, α1AT的结合环和P1侧链残基标为红色; Ornithodorin的N端标为红色; Ornithodorin的第二结合位点标为橘黄色 Figure 2 Examples of serine-protease comlexs Note: A: Standard mechanism, Cucurbita maxima trypsin inhibitor and trypsin; B: Non-standard mechanism, Ornithodorin and thrombase. In the figure, β-sheet is shown in blue; α-helix is shown in green; CMTI, the associative ring of α1AT, the side chain of P1 and N terminal of Ornithodorin are in red; The second binding site of Ornithodorin is in orange

同时，Olson和Gettins (2011)从抑制底物蛋白酶出发提出了一种基于底物的抑制机制，该反应机制认为丝氨酸蛋白酶抑制剂通过RSL结构与靶酶识别并结合，形成非共价的复合物，然后靶酶通过裂解丝氨酸蛋白酶抑制剂的RSL结构，使得丝氨酸蛋白酶抑制剂的构象发生改变，从而丝氨酸蛋白酶抑制剂 与靶酶之间形成共价的紧密结合，形成较为稳定的酰基-酶结合物。这种结合使得靶酶的活性位点构象改变，进而失去蛋白酶活性。但这种酶与抑制剂的结合并不是非常稳定，在一定条件下蛋白酶可被水解使得靶酶恢复活性。

另外，Radisky和Koshland (2002)提出了“排水沟阻塞机制”用以解释丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用机制，该机制认为丝氨酸蛋白酶抑制剂可以迅速和蛋白酶形成一种酰基化中间产物，这种中间产物内具有紧密的、定向的新键，从而导致蛋白酶水解的后续反应速率显著下降，而且这种中间产物不易分解并倾向于逆反应，从而导致在整个反应过程中酶类似于排水沟被杂物堵塞水流不能流通一样无法行使其催化作用。但是上述机制并不适用于大分子量的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

4丝氨酸蛋白酶抑制剂的生物活性
蛋白酶存在于从各种各样的生物体内，控制着胞外和胞内无数的水解反应，如果蛋白酶的水解反应不受控制将导致严重的疾病或者功能紊乱，因此必须对蛋白酶的水解反应进行精确控制(Mangan et al., 2008)。最基本的控制方法是通过蛋白酶原的激活、表达或分泌的调节以及天然蛋白酶的降解来完成(Makhatadze et al., 1993)。另一种控制途径是通过调节蛋白酶的水解活性来完成(Olson et al., 2010)。绝大多数丝氨酸蛋白酶抑制剂通过与靶酶活性位点的作用来调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡，从而维持生物体内环境的稳定，其主要的一个功能是利用其活性结合位点与靶酶结合，从而清除体内不必要的丝氨酸蛋白酶。但是少数丝氨酸蛋白酶抑制剂在进化过程中失去了抑制特性成为激素载体或者激素前体，例如血管紧张素原(Makhatadze et al., 1993)。丝氨酸蛋白酶抑制剂在人体内发挥着重要作用，其功能障碍将导致血栓形成、肺气肿、肝硬化、免疫系统的过敏以及神经性疾病等。

在人类及动物中，存在于血液中的丝氨酸蛋白酶抑制剂，与凝血、纤溶以及血压调节等有关。同时存在于神经系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可能具有神经保护作用，能够有效调节中枢神经系统的动态平衡，对于脑损伤、神经变性以及神经元死亡起着极为重要的作用。抗凝血酶及其辅因子肝素和硫酸乙酰肝素能够有效抑制血液中凝血蛋白酶的活化，在血液抗凝结过程中发挥关键作用(Laskowski and Kato, 1980)。人体中的Serpin10可以抑制凝血因子Z和XI的激活，缺失该抑制剂蛋白将导致静脉血栓形成。Murthy等(2000)发现绿豆中的BBI可以有效抑制登革热疾病中有关病毒复制的关键蛋白酶NS3，并对NS3和该抑制剂的结合物的晶体结构进行了解析(Tomlinson et al., 2009) 。在黑腹果蝇中，Serpin-28调节血淋巴酚化酶的活化过程，该酶在催化伤口附近的黑色素沉积方面发挥着重要作用，缺失该抑制剂将导致组织的大范围黑化及角质层色素缺失(Radisky and Koshland, 2002)。在烟草天蛾幼虫体内，血淋巴蛋白酶8(HP8)促进抗菌蛋白的合成，Serpin-1J通过抑制HP8使得幼虫血淋巴抗菌活性的降低以及杀菌肽表达量的减少(An et al., 2011)。

在植物中，丝氨酸蛋白酶抑制剂既可以防御相应微生物及昆虫的侵害，在植物种子的休眠期也可以调节植物的内源性蛋白酶，使其正常生长。在某些动植物体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制其致病性微生物的蛋白酶活性，从而在针对外源侵染过程中发挥主动防御能力。在牧豆树中得到的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂可通过影响C.maculatus幼虫的消化系统从而表现出抵御昆虫侵害的能力(Macedo et al., 2004)。另外，相较于普通甘蔗，BBI和Kunitz类抑制剂在甘蔗中表达，能够有效阻碍小蔗螟幼虫的生长(Scherfer et al., 2008)。 在此我们可以考虑使用适当的丝氨酸蛋白酶抑制剂在害虫防治及抑制传播上发挥重要作用。值得注意的是，伴随着对于植物中的丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究深入，我们发现很多与植物致病侵染抗性相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂表现出抑制致癌作用的潜力。

在有关癌症方面的研究，蛋白C抑制剂(PCI)是一个血浆蛋白酶抑制剂，通过抑制组织蛋白酶L(Capthepsin L)来调节人类乳腺癌细胞的转移(Fortenberry et al., 2010)。另外，肿瘤细胞的稳定性及其增殖扩散与基底膜的降解有直接的联系，PAI-1在肿瘤细胞中诱导成纤维母细胞的衰老，进而导致基质膜的降解，从而直接影响肿瘤细胞的促进增殖及抑制凋亡作用(Gramling and Church, 2010)。

如前所述，目前主要利用物理、化学或者生物化学方法，从动植物及微生物体内收集材料例如动物的血液以及植物的块根块茎等提取各类丝氨酸蛋白酶抑制剂(Falco and Silva-Filho, 2003)。众所周知，海洋是一个十分独特的生态环境，包罗了高盐、高压、低温 (尤其是深海)、低光照、寡营养等特点，还有无光照以及局部高温的极端环境(Fortenberry et al., 2010)。来自海洋的微生物大部分都是适应了极端环境的极端微生物。据估计海洋微生物可达0.1~2 亿种。已发现的类群主要包括：病毒、古菌、细菌、粘细菌、微藻、真菌。海洋微生物的物种多样性决定了其代谢产物多样性，海洋环境是新型生物活性物质的源泉。海洋环境也包含了大量的未知功能基因。利用宏基因组文库技术开发环境未培养微生物资源，可以使得占微生物通量99%的不可培养微生物基因资源开发变成现实，它将微生物基因的探索空间扩大了上百倍(Gramling and Church, 2010; Jiang et al., 2010)。宏基因组文库技术，就是以直接分离环境未培养微生物宏基因组DNA，克隆目标DNA到合适的载体，然后导入宿主菌进而实现对目标克隆的筛选。当前，科学家以E. coli或者Streptomycin lividans作为克隆宿主，构建了各种各样的文库如plasmid libraries、cosmid libraries、BAC libraries、fosmid libraries等，基于基因功能表达和序列特异性的同源筛选等给人们带来了数量巨大的新型活性酶和各种生物活性物质(Kennedy et al., 2010)。因此，利用宏基因组学技术，研究极端环境体系未培养微生物和克隆未培养微生物酶基因，分离筛选各类丝氨酸蛋白酶抑制剂，在理论上及在实际应用中都具有特别重要的意义，目前国际上鲜见有关未培养微生物新型丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究报道。

5展望
丝氨酸蛋白酶抑制剂具有广泛的生物活性和作用，在新药研制和防治疾病方面具有广阔的前景。从细菌或植物中提取得到的某些无毒性丝氨酸蛋白酶抑制剂现在已可以商业应用于治疗丝氨酸蛋白酶诱导的皮肤炎症，例如土豆块茎中的某些蛋白可抑制人类排泄物中的丝氨酸蛋白酶，可用于治疗肛周炎等。从土豆块茎中提取得到的G-蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制剂)具有抑制致病菌R. solani(水稻致病菌)，C. albicans(引起口腔、食道和生殖泌尿系统念球菌感染)和L .monocytogenes(引起食物中毒)的作用，可用于疾病治疗和防治病虫害(Kim et al., 2006)。从牡蛎血液中提取得到的cvSI-1能够有效抑制牡蛎寄生虫消化系统中的丝氨酸蛋白酶，在牡蛎针对寄生虫的主动防御过程中发挥突出作用(Xue et al., 2006)。因此我们应该加强对于分子质量小、活性高的丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究，深入研究其功能和结构之间的关系，阐明其作用机理，为临床实践奠定基础。同时，通过研究人体内抑制剂及靶酶的相互作用机制，探索相关疾病的致病机理，从而获得疾病防治的新思路。

已知现有的丝氨酸蛋白酶抑制剂一般都是通过蛋白分离纯化技术从动植物体内获得，该方法受限于技术、成本等问题，不能有效筛选获得新的抑制剂基因，同时也不能大量低成本地获得抑制剂蛋白，从而使得丝氨酸蛋白酶抑制剂不能大规模的生产。在此，我们一方面可以利用宏基因组文库和克隆文库等新方法筛选获得新的抑制剂基因(Jiang et al., 2011)，同时改造已有的抑制剂基因，以期获得满足各种需要的高质量抑制剂基因。另一方面，构建含有抑制剂基因的工程菌株，利用微生物发酵方法具有成本低、产量大和可控性高等优点，尝试进行规模化生产，满足人们对于抑制剂的实际需要。

作者贡献
郝振宇负责论文的框架构建、写作以及论文所涉及的实验开展；曾蓉完成论文的润色以及部分实验数据的验证；申佩弘负责论文涉及的DNA以及蛋白质数据的生物信息学分析；武波负责论文格式的修正；蒋承建为论文的通讯作者，论文所反映的实验数据全面把关以及基金项目的主持者。

致谢
感谢国家自然科学基金(31060016)和广西自然科学基金(2011GXNSFA018073)对本研究的共同资助。感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

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