鹅业发展符合我国的人口多、土地少、资源相对不足的国情，充分利用林地、果园、滩涂等非农土地进行种草养鹅，可以在不占有更多资源的基础上提供更多的产品。鹅全身是宝，经济价格高。鹅肉蛋白质含量高，脂肪含量低(且多为不饱和脂肪酸)；鹅掌、肝、肫、肠等副产品也可加工成畅销食品；鹅羽绒轻、柔、暖，可以制成羽毛球、装饰品和羽绒服。目前鹅的饲养量不能满足消费者的需求。发展鹅业是符合畜牧业发展的需求，并是一个可持续发展的事业。

极大的地理差异和文化特点形成了众多的鹅品种资源，这些资源在外貌和生产性能上各具特色，为人类选育鹅新品种(系)提供了资源条件。品种的选育包括外貌、生产速度、产肉性能等指标，这些指标的快速优化的方法之一就是通过同质或者异质杂交。传统的鹅育种工作多数采用外貌、生产性能、体尺等指标直接或者间接的选择方式，需要消耗大量的财力和物力，而且育种世代间隔长，在一定程度上限制了育种速度。近年来，随着人类基因组及后基因组计划的提出和实施，一些基因的功能作用研究渐渐明朗，挖掘或筛选出影响动物重要经济性状的功能基因是研究者近期研究的热点之一。

生长激素(growth hormone, GH)是一种具有种属特异性的单链蛋白质激素，由动物脑垂体前叶嗜酸性细胞合成、分泌的，通过影响动物的糖、蛋白质和脂肪的代谢作用，促进动物肌肉、骨骼的生长产发育，从而极大地影响的动物的生长形势。GH基因由5个外显子、4个内含子或6个外显子、5个内含子组成，cDNA长度一般为800～1 200 bp，信号肽为16～27个氨基酸残基，成熟肽为186～191个氨基酸残基(Vasilatos-Younken et al., 1999)。畜禽的GH基因存在丰富的多态性，猪GH基因第2外显子上有6个点突变，第3、4外显子上各有一个点突变，内含子上共有16个点突变，部分突变与猪生产性能存在关联性(Larsen and Nielsen, 1993; 陶勇等, 2003; 王文君等, 2002)。牛GH基因多态位点与乳脂率、乳蛋白和产奶量相关(Falaki et al., 1997; Hoj et al., 1993; Lucy et al., 1993)。与哺乳动物相比，禽类GH基因序列的突变研究相对落后，主要集中在鸡上，已经有了多态性与生长速度、腹脂沉积和繁殖性能等方面的相关性研究(Kuhnlein et al., 1997; Fotouhi et al., 1993; 欧阳建华等, 2006; 李长春等, 2005)。鹅的研究报道较少，熬金霞等(2006, 中国畜牧杂志, 42(7): 9-11, 53)在内含子上检测到了2个单核苷酸多态，并分析了不同基因型间体重存在极显著差异；赵文明等(2008)在籽鹅内含子上发现了7个突变，部分突变与体重、屠宰性状存在显著性差异。

本实验根据鹅GH基因的mRNA和鸭的DNA序列在第2外显子上设计了1对引物，以国外品种莱茵鹅，我国地方品种扬州鹅、豁眼鹅和四川白鹅4个鹅品种为实验材料，运用单链构象多态(single strand conformation polymorphism, SSCP)方法在鹅GH基因第2外显子上检测是否存在单核苷酸突变(single nucleotide polymorphisms, SNPs)，推断是否引起氨基酸序列发生变化，并分析不同鹅群体中基因型频率、等位基因型频率和各个遗传参数，以期为研究该基因的生物学功能和鹅的选种、选育工作提供参考。

1 结果与分析
1.1 PCR-SSCP检测结果 
实验所得的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，通过拍照初步查看条带的大小约为175 bp与预期一致，并且条带单一无杂带，可以进行下一步实验(图1)。

图1 部分样品PCR扩增结果 Figure 1 The result of PCR amplification of some samples

 
多态性检测结果显示第2外显子上存在多态，将纯合子定义为AA、BB、CC和DD型，根据纯合子将相应的杂合基因型判定为AB、BC、CD、AC、AD和BD型，共计10种基因型(图2)。
 

图2 不同品种鹅PCR扩增片段的SSCP分析 Figure 2 SSCP analysis on PCR amplification on the different goose breeds

1.2 多态片段的序结果
利用胶回收试剂盒分别回收AA、BB、CC和DD纯合基因型的PCR产物，通过克隆、测序获得片段序列。运用生物学软件DNAMAN 6.0.3.99进行序列同源性比对，共发现了2个单碱基突变，均为T-C突变，分别为编码区序列第39和第74位碱基。与GenBank中公布的鹅GH基因型序列(AY149895)相比较，AA型在第74位碱基处发生突变；BB型与之一致；CC型在两处均发生了突变；DD型在第39位碱基处发生突变(图3)。其中T39C突变未引起氨基酸序列变化，为沉默突变；T74C突变导致第25位氨基酸由缬氨酸(V)变为丙氨酸(A)(图4)。   

图3 不同基因型间测序结果比较 Figure 3 The result of sequence comparison among different genotypes

图4 不同基因型间氨基酸序列的比较 Figure 4 The result of amino acid sequence comparison among different genotypes

 
1.3基因型(基因)频率在鹅群中分布情况
对60个个体进行基因型检测，计算不同鹅品种的基因型、等位基因频率(表1)。莱茵鹅、扬州鹅和四川白鹅中均未检测到AA型，四川白鹅中也未发现AB、AD和BB型，豁眼鹅中未检测到CC型，其它基因型在群体中均能检测到。在莱茵鹅中B等位基因频率最高，C等位基因次之，A等位基因最低；在扬州鹅、四川白鹅中C等位基因频率最高，D等位基因次之，A等位基因频率最低；在豁眼鹅中D等位基因频率最高，其它3个等位基因的频率相近。

不同基因型在不同鹅品种之间分布存在差异，由表2可知，除扬州鹅和四川白鹅外，其它不同鹅品种两两之间基因型分布存在极显著差异。

表1 不同鹅品种基因型和等位基因频率表 Table 1 Genotype and allele frequency of different goose breeds

表2 不同鹅品种基因型分布比较 注: 括号中数据为自由度, *表示差异显著,**表示差异极显著; χ2 (8) 0.05=15.507, χ2 (8) 0.01=20.09, χ2 (9) 0.05=16.919, χ2 (9) 0.01=21.666 Table 2 The comparison of genotype distribution in different goose breeds Note: The number of brackets is degree of freedom. * indicates significantly difference. ** indicates very significantly difference

1.4 不同品种群体遗传特性分析
不同鹅品种的纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量见表3。四川白鹅在该位点的纯合度最高(0.4333)，扬州鹅次之，豁眼鹅最低。豁眼鹅的有效等位基因数比较接近于4，莱茵鹅的接近于3，其它两个鹅品种有效等位基因数接近于2.5。4个鹅品种PIC均大于0.5为高度多态，其中豁眼鹅最高，莱茵鹅次之，四川白鹅最低。

表 3 不同鹅品种GH基因的遗传参数分析 注: 高度多态时PIC>0.5, 中度多态时0.5>PIC>0.25, 低度多态时PIC<0.25 Table 3 The analysis of genetic polymorphic about GH gene in goose breeds Note: PIC>0.5 indicates a high level of polymorphism, 0.5>PIC>0.25 indicates an intermediate level of polymorphism, PIC<0.25 indicates a low level of polymorphism

2 讨论
生长激素是调控脊椎动物骨骼和肌肉生长发育的重要激素，主要是通过加快蛋白质合成速度、脂肪代谢、葡萄糖消化吸收等方式来影响机体(孙逊和朱尚权, 1999, 国外医学生理、病理科学与临床分册, 19(1): 6-9)。在对猪、牛等动物注射外源性生长激素，结果表现为增加了肌肉产量、骨骼生长较快，降低脂肪含量和提高了饲料报酬等方面(Mikel et al., 1993; Fabry et al., 1991; Stelwagen et al., 1992; Phipps et al., 1997)。熬金霞等(2006, 中国畜牧杂志, 42(7): 9-11, 53)在内含子上检测到了两个单核苷酸多态，并分析了不同基因型间体重存在极显著差异。赵文明等(2008)在籽鹅内含子上发现了7个突变，部分突变与体重、屠宰性状存在显著性差异。本研究在鹅的GH基因第2外显子上共检测到了2个点突变，均为T-C突变，共形成了10种基因型，其中纯合型分别为AA、BB、CC和DD，杂合型为AB、AC、AD、BC、BD和CD，个别基因型为品种所特有，如豁眼鹅的AA型。两处点突变分别为GH基因编码区第39和第74为碱基，后一个突变引起了氨基酸突变，由原来的缬氨酸(V)变为丙氨酸(A)。不同基因型在鹅品种中的分布情况显示：除扬州鹅和四川白鹅外，其它鹅品种之间基因型分布存在极显著差异，这些差异是品种受到自然条件和人为因素等选择压力的作用下，形成了各自的特色，可能成为育种的素材。

对群体遗传参数的分析可以了解群体的纯合程度、基因变异程度的高低。当群体表现为低度多态时PIC<0.25，中度多态时0.5>PIC>0.25，高度多态时PIC>0.5。本实验中4个鹅品种的PIC在0.5118、0.6839之间，差异较大，但是均为高度多态，说明了GH基因第2外显子点突变处多态性西含量很高。当一个群体纯合度高、PIC低说明群体内在突变位点处遗传变异程度小，将群体进行纯合性选择的波动范围小；反之，纯合度低、PIC高，说明群体在突变位点处遗传变异程度大，选择波动范围也大。由本实验遗传参数分析结果可见豁眼鹅在GH基因方面选择的遗传潜力最大，莱茵鹅次之，说明了这些品种在GH基因第2外显子突变位点处可以进行提高纯合性，增加群体遗传一致性。

莱茵鹅、扬州鹅、豁眼鹅和四川白鹅4个鹅品种GH基因第2外显子序列中有点突变，并且群体遗传多样性高，这使得多态性与生产性状相关性研究成为可能，进而确定GH基因能否用于鹅生产性能的辅助选择标记奠定了基础。

3 材料和方法
3.1 实验材料
以莱茵鹅、扬州鹅、豁眼鹅和四川白鹅为研究素材，血样由国家级水禽基因库提供，每个品种各60只，其中公鹅12只。血样采用4％EDTA抗凝，离心获得红细胞。

3.2引物设计
根据GenBank公布的鹅GH基因的mRNA(AY149895)、鸭GH基因的DNA(AB158760)序列设计了一对引物，引物上游序列为5′-GTCGTGGTTTTCTCCTCTC-3′、下游序为5′-GCTGTACACT TACGAACTC-3′，用于扩增第2外显子序列，引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。

3.3 PCR-SSCP分析
吸取少量的红细胞采用酚/氯仿法提取基因组DNA，用TE进行溶解，用分光光度计测定浓度后调整浓度至约100 ng/μL。

PCR反应体系为25 μL，各个试剂的终浓度：1U Taq酶、1×PCR buffer(without Mg²⁺)、1.5 mmol/L MgCl₂、0.8 mmol/L dNTPs、100 ng DNA模板、0.4 pmol/L上、下游引物。PCR扩增条件：94℃变性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s， 循环30次；最后72℃延伸10 min；4℃保温30 min，即可取出使用。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，条件为150 V 30 min，然后用凝胶成像系统拍照查看PCR扩增结果。

吸取PCR产物2 μL、上样缓冲液5～6 μl进行混合用于SSCP分析，98℃变性10 min后插入冰中放置5 min。然后将混合液在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis=29:1)中电泳。电压为10 V/cm，电泳时间为8～9 h，采用银染方法进行显色。

3.4 纯合基因型片段的克隆和测序
将每种纯合基因型分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段用试剂盒回收DNA片段，将回收产物与PMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经过PCR、酶切检测后，将阳性克隆送于上海桑尼生物科技有限公司进行测序。

3.5 数据统计分析
分析每个品种的基因型，并对每个品种进行基因型统计，计算各个品种的基因型、等位基因频率，利用SPSS13.0软件的卡法方法分析不同鹅品种间基因型的分布情况，计算出品种的遗传参数。

作者贡献
杨廷桂是本研究的实验设计和实验研究的执行人；段修军提供水禽品种资源，参与实验设计。王健是负责实验数据的处理和分析工作；孙国波、董飚负责实验室分析、论文写作和修改等工作。

致谢
本文论受到江苏省农业科技自主创新资金[CX(09)638]，资助。实验实施过程中还得到了扬州大学动物科学与技术学院龚道清教授、江苏畜牧兽医职业技术学院张玲老师、国家级水禽基因库卞友庆老师等帮忙，在此表示感谢！同时感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

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