高分辨率熔解(high-resolution melting, HRM)早在1974年被用于DNA检测(Michel et al., 1974;  Steinert and van Assel, 1974)，早期主要针对长度和GC含量变异较大的大片段DNA，如线粒体DNA (Michel et al., 1974)。后来，HRM逐渐用于较短DNA片段的分析，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)产物，它可以有效检测片段长度和GC含量的较小变异(Ririe et al., 1997)以及区分杂合子与纯合子(Toyota et al., 2000; Hiratsuka et al., 2002)，但不同纯合子之间的鉴别仍比较困难。自2000年以来，利用荧光标记的探针大大提高了HRM检测的灵敏度和准确性，可以有效鉴定PCR产物间单个碱基的变异(Bennett et al., 2003; Reed et al., 2007)，即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。近年来，随着饱和荧光染料的发展，HRM检测可以不使用价格较贵的探针，而在常规PCR中直接加入饱和荧光染料，这就大大简化了实验流程，显著降低了实验成本(Liew et al., 2004; Gingeras et al., 2005; Hoffmann et al., 2007)。目前，HRM的技术专利为美国Idaho Technology公司持有(专利号2005-02333335和2006-0019253)。

HRM是检测SNP、简单序列重复(simple sequence repeats, SSR, 也称微卫星)和插入/缺失(insertion/deletion, Indel)等多种DNA变异(或称分子标记)的有效技术，在植物品种鉴定、遗传图谱构建、基因定位与标记辅助选择、突变检测等研究中应用广泛。本文对HRM的技术原理、检测仪器的要求及其在植物DNA变异检测中的应用进行了综述，以期为植物相关研究提供有益的参考。

1 HRM的技术原理
一些染料在DNA双链中会发出荧光，在升温过程中DNA双链解链熔解、荧光减弱，在变为单链时尤为急剧，从而形成熔解曲线，熔解曲线的形状与DNA片段长度、GC含量和碱基序列有关(Ririe et al., 1997)。其中，Tm为荧光降低50%的温度，其差别直观反映了目标DNA序列的变异(Wilhelm and Pingoud, 2003)；Tm值的精确计算需要去除背景荧光(低温的线性下降和高温的指数下降)，专用软件则可去除背景、产生正态化的熔解曲线。

荧光染料包括非饱和荧光染料和饱和荧光染料。非饱和荧光染料，如SYBR Green I，在DNA熔解开始后，释放出来的荧光染料可以再掺入未解链的、不含染料的DNA双链位置，使得荧光变化不能准确反映DNA序列的变异(Giglio et al., 2003)。相反，饱和荧光染料，如LC Green Plus，可以饱和地掺入DNA双链，则DNA熔解过程中的荧光变化能够直观反映DNA片段的特征(Mackay et al., 2008)。 

结合饱和荧光染料，HRM分析的优势明显，如：(1) PCR中只增加荧光染料的成本，不需设计探针，不需进行引物标记，一般小于1 000 bp的片段不需重新设计PCR引物；(2) 通量较高，如Idaho公司的LightScanner检测仪可在5分钟内检测一块96或者384孔板的样品；(3) 操作简便，常规PCR后不需电泳和其他片段分离操作；(4) 准确性较好；(5) 样品可用于下游测序和其他检测工作。因此，HRM是一种高通量、快速、高灵敏度、低成本、闭管的突变与基因型检测方法(Croxford et al., 2008; Studer et al., 2009)。但要注意的是，HRM不能完全代替测序，其只能通过对熔解曲线不同的代表性样品的测序而大大减少测序的工作量，这在基因型相对不多、样品量极大时优势显著。

2 HRM检测的仪器及其要求
由于HRM的主要目的是区分DNA片段的单碱基差异，因此对DNA熔解过程中的温度变化的精确性和灵敏度要求很高。常规熔解曲线分析中一般每步升温1℃，而高分辨率熔解曲线分析每步升温0.02~ 0.1℃。目前，可进行HRM检测的仪器有26种或者更多(Herrmann et al., 2006)，包括一些定量PCR仪，如美国ABI公司的7000系列、Roche公司的LightCycler系列、Bio-Rad公司的iCycler、Cepheid公司的SmartCycler以及澳大利亚Corbett公司的Rotor-Gene等。美国Idaho公司推出了专门进行HRM分析的两款仪器，包括HR-1和LightScanner (包括96孔板和384孔板配置)。Herrmann等(2006)比较了多台仪器的有效性，发现Idaho HR-1在纯合子间多个Tm差值情况下信嗓比最高，且误检率最低，但HR-1一次只能检测1个样品，通量相对较低。

另外，对于同时检测多个样品的HRM仪器，温度的均一性对实验结果的可靠性具有重要影响。两孔之间如果温度相差0.5℃，就可能导致最终的熔解温度相差0.5℃，从而无法保证HRM分析结果的准确性。大多数常规定量PCR仪的孔间温差一般都在0.5℃以上，因此无法满足HRM检测对温度均一性的要求。Herrmann等(2006)比较了适于96孔板检测的HRM仪器的温度均一性，发现Idaho LightScanner的均一性最好，但也达0.35℃。

3 HRM在植物DNA变异检测中的应用
HRM可以有效检测DNA水平的SNP、SSR和Indel等多种变异，技术上比其它方法更具优势。比如，HRM检测SSR变异时，成本和通量均优于高分辨率琼脂糖凝胶电泳和基于测序仪的全自动检测(Reed et al., 2007)。目前，HRM已广泛用于以DNA变异为基础的植物多个研究方向，包括品种鉴定、遗传图谱构建、基因定位与标记辅助选择、突变检测等。

3.1 HRM在植物品种鉴定中的应用
利用HRM进行植物品种鉴定中，开始主要是检测SSR标记，如鉴定葡萄 (Vitis spp.)品种(Mackay et al., 2008)和牛至属(Origanum spp.)植物(Mader et al., 2008)。稍后，HRM在植物品种鉴定中检测的标记扩展至SNP和Indel等，已报道的植物种类包括扁桃[Prunus dulcis (Miller) D.A. Webb] (Wu et al., 2008)、橄榄(Olea europaea L.) (Muleo et al., 2009)、二棱大麦(Hordeum vulgare L.) (Hofinger et al., 2009)和马铃薯(Solanum tuberosum L.) (Koeyer et al., 2010)等。

HRM还可用于确定目的DNA片段的PCR产物的相对剂量，从而鉴别品种的倍性。例如，HRM可有效鉴定二倍体和四倍体的马铃薯品种(Koeyer et al., 2010)。

HRM用于植物品种鉴定中，由于品种间在某个DNA片段上的变异可能较为复杂，从而导致熔解曲线混乱或者差异不明显、分型困难，因此需要注意HRM的灵敏度。鉴于此，除了在PCR中加入饱和荧光染料的普通操作外，有两种方法可以提高HRM的灵敏度：一是在PCR产物中加入互补的、非标记的寡聚核苷酸作为温度参照，可以降低错检率、有效识别不同的纯合子(Seipp et al., 2007)；二是在3'端加上非标记的探针，非对称PCR后的HRM曲线将包括探针部分和PCR产物部分，探针部分的熔解曲线将取决于目的序列与探针的互补配对情况，PCR产物的熔解曲线取决于整个序列，从而提高DNA变异检测的准确性(Zhou et al., 2004)。第二种方法的优点在于不需知道目的DNA片段的各单倍型或者各等位片段的序列信息，如果两个品种的探针部分和PCR产物的熔解曲线一致，即可认为是相同的基因型，这对多倍体的检测尤其有用(Koeyer et al., 2010)。

3.2 HRM在植物遗传图谱构建中的应用
由于HRM可有效检测的SNP、SSR和Indel等均为共显性DNA标记，故HRM能够区分不同变异类型的杂合子与纯合子，从而检测各种标记在亲子代的分离。因此，HRM可有效用于遗传图谱构建。同时，由于遗传图谱构建往往需要较大的作图群体和大量的候选标记，通量会大大影响实验效率，HRM的高通量为此提供了不错的技术选择。比如，结合自动移液工作站进行PCR反应配备，8个小时即可完成500个样品的PCR、HRM检测和数据统计工作，而同样的样品做单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)需要3 d左右(Wu et al., 2009)。

目前，利用HRM进行遗传图谱构建的植物包括白羽扇豆(Lupinus albus L.) (Croxford et al., 2008)、二棱大麦(Lehmensiek et al., 2008)、苹果(Malus domestica Borkh.) (Chagné et al., 2008)、扁桃(Wu et al., 2009; 2010)和黑麦草(Lolium perenne L.) (Studer et al., 2009)。例如，Studer等(2009)研究了包含SNP、SSR和/或Indel的4个黑麦草表达序列标签(expressed sequence tag, EST)在F₂谱系中的分离，通过测序确认了亲子间熔解曲线的分离与碱基变异的一致性，并且符合孟德尔遗传，最后将EST定位到遗传图谱上。此外，李发根(2010)以尾叶桉(Eucalyptus urophylla S. T. Blake)细叶桉(E. tereticornis Smith)作图群体为材料，利用HRM研究了父本细叶桉上存在(个体内)SNP的2个EST (GO248243和CD668299)在子代的分离，也确认了熔解曲线与碱基变异的一致性，并将EST整合到父本的遗传图谱上。

HRM也可针对某个DNA标记进行细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)文库的筛查，从而确定包含一致序列的BAC克隆，这为遗传图谱与物理图谱的整合提供了经济、便捷的技术手段。目前，这方面应用已在拟南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh] 上报道(Vu et al., 2010)。

3.3 HRM在植物基因定位与标记辅助选择中的应用
Lehmensiek等(2008)利用HRM进行了二棱大麦坚黑穗病(病原为Ustilago hordei (Pers.) Lagerh)抗性基因Ruh.7H的定位，该基因与一个HRM检测的标记(AV836787)的图距仅为3.8 cM。Croxford等(2008)利用HRM在遗传图谱上进行了白羽扇豆花色、生物碱含量和茎高等性状的数量性状位点(quantitative trait locus, QTL)定位。HRM的高通量和经济性在基因定位研究中表现得更加突出，由于在某DNA片段上二倍体的作图子代最多包含四种基因型，因此几百甚至几千个子代的熔解曲线最多也只有四种类型，针对不同类型的熔解曲线最多只需测序4个样品即可确认相应的基因型。

HRM可以对一些候选基因进行分型，因此可以用于标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)。例如，利用HRM进行马铃薯品种鉴定时(Koeyer et al., 2010)，LS034P为金线虫[Globodera rostochiensis (Wollenweber) Behrens]致病型Ro1的抗性基因，dfr和f3'5'h为块茎表皮颜色相关基因，bch为块茎肉色相关基因，这为有关性状育种中的亲本选配和早期子代选择提供了可靠的分子标记技术。

3.4 HRM在植物突变检测中的应用
单碱基改变、插入和缺失等DNA突变都能通过HRM检测。与其他突变检测方法相比，HRM具有类似或者更高的灵敏性(Liew et al., 2004)。例如，HRM用于橄榄品种在光敏色素相关基因phyA的突变检测时，对于长达307 bp的PCR产物仍然具有很高的灵敏度；对于小于100 bp的PCR产物，即使C/G或A/T突变的纯合子间熔解温度相差仅0.32℃，也能有效检测(Muleo et al., 2009)。另外，HRM也被用于筛选EMS诱变处理的栽培一粒小麦(Triticum monococcum L.)在Rym4和GA20ox1A两个基因上的突变株(http://www.wgin.org.uk/wgin_2003-2008/Stakeholders/WGINStake holderNewsletterMarch2007.pdf)。

由于突变的频率一般很低，突变的准确检出对HRM灵敏度的要求更高，必要时需要结合测序和/或利用探针进行分析(Koeyer et al., 2010)。

4展望
HRM检测的硬件投入不高，有的HRM仪器价格只有三万多美元，一般的实验室较易购置。与其它技术相比，HRM的灵敏性、高通量和低成本等优势使其在多个研究领域均有应用，包括对准确性要求很高的医学诊断(Gingeras et al., 2005)。今后，HRM技术的发展可能侧重于：(1)准确性的进一步提高，如改进仪器控温的准确性和开发新型染料等；(2)更大限度地降低费用，包括仪器、试剂和耗材的成本；(3)提高实验通量，如HRM多重检测技术和配套的自动化操作体系以及与其他技术的交叉结合；(4)配套技术的开发，如之前通过数学方法将亚硫酸氢盐处理的DNA样品的熔解荧光数据标准化，则可通过熔解开始和结束的温度反映甲基化的水平，从而实现HRM对甲基化的定量检测(Smith et al., 2009)，类似的技术开发亦可拓展HRM的应用方向。

HRM用于植物DNA变异检测的历史较短，但已涉及多个研究方向。尤其是随着多种植物基因组资源的积累，基于已知序列和功能基因的DNA变异检测将越来越普遍。具体地，HRM进一步用于植物有关研究的主要工作包括：(1)扩展应用方向，如DNA甲基化检测(Wojdacz and Dobrovic, 2007)和RNA编辑的定量检测(Chateigner-Boutin and Small, 2007)；(2)扩大植物种类，尤其是非模式植物(包括林木)；(3)针对特异的目标DNA片段进行相关技术的开发、优化与配套，建立专一的检测体系。因此，我们相信，近期内HRM将在更多的实验室用于更多的植物研究领域，并将大大促进植物有关研究的发展。

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