在板栗疫病菌线粒体中检出低毒病毒编码蛋白p29

王方贞 ,; 全睿 ,; 陈本勇 ,; 王金子 ,; 商巾杰 ,; 陈保善 ,

在板栗疫病菌线粒体中检出低毒病毒编码蛋白p29

王方贞

, 全睿

, 陈本勇

, 王金子

, 商巾杰

, 陈保善

亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西大学生命科学与技术学院, 南宁, 530005

作者

通讯作者
基因组学与应用生物学, 2012 年, 第 31 卷, 第 8 篇
收稿日期: 2011年12月16日接受日期: 2012年01月19日

推荐引用：

引用格式(中文)：
王方贞等, 2012, 在板栗疫病菌线粒体中检出低毒病毒编码蛋白p29, 基因组学与应用生物学(online) Vol.31 No.1 pp.45-50 (doi: 10.5376/gab.031.000045)
引用格式(英文)：
Wang et al., 2012, Detection of Hypovirus Protein p29 from Mitochondria of the Chestnut Blight Fungus, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (online) Vol.31 No.1 pp.45-50 (doi: 10.5376/gab.031.000045)

摘要

p29蛋白是低毒病毒基因组编码的一个木瓜蛋白酶样蛋白。前人研究发现，在宿主板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)体内表达p29，会引起真菌毒力降低，色素产生减少，丧失产生无性孢子的能力。除已知p29与源于高尔基体的膜结构共分离之外，p29在细胞内的其他分布形式未明。本研究在成功制备p29特异抗体和高效分离板栗疫病菌线粒体的基础上，尝试用p29抗体检测线粒体中是否存在p29蛋白。Western印迹结果表明，受CHV1-EP713感染的EP713菌株线粒体中存在与p29抗体特异作用的病毒蛋白。本研究结果暗示，低毒病毒蛋白p29可能参与调控宿主线粒体功能。

关键词

板栗疫病菌；低毒病毒；线粒体；p29蛋白定位

低毒病毒(Hypovirus)是一类存在于板栗疫病菌中自主复制的无衣壳正链RNA病毒，其代表种是CHV1-EP713 (Shapira and Nuss, 1991)。按照遗传结构的不同，目前低毒病毒属包含4个种: CHV1、CHV2、CHV3和CHV4 (Dawe and Nuss, 2001; Linder-Basso et al., 2005)。作为研究最为深入的真菌病毒之一，低毒病毒受到广泛关注的主要原因，早期是由于其具有调控板栗疫病菌－一种给北美板栗森林带来毁灭性灾难的外来病原毒力的能力(低毒力)，而作为生物防治制剂来研究(Day et al., 1977)，近二十年来则逐渐演变为研究病原真菌致病力构成和调控机制，以及研究病毒与宿主相互作(商巾杰和陈保善, 2009)。

受低毒病毒感染后，板栗疫病菌最突出的变化是致病能力显著降低(称低毒性, hypovirulence)。伴随这种低毒性的其它性状，称为低毒性相关性状(hypovirulence-associated traits)，包括桔黄色素分泌减少，漆酶分泌减少，无性分生孢子形成减少，以及雌性不育(Anagnostakis, 1982)。转录组学研究表明，低毒病毒感染在全局范围内改变了宿主基因表达谱(Dawe and Nuss, 2001; Shang et al., 2008)。信号传导研究表明，包括异质三联体G蛋白信号传导途径、Ca信号传导径和MAPK信号传导途径都受到了病毒的干扰(商巾杰和陈保善, 2009)。1995年，Monteiro-Vitorello等(1995)获得了一个表现低毒性的线粒体基因突变体。该突变体同时表现出无性分生孢子形成减少和雌性不育等低毒性相关性状。对线粒体基因突变体和低毒病毒感染菌株的转录谱进行比较，发现超过三分之二的转录异常的基因具有相似性，暗示低毒病毒对宿主真菌的调控，很大程度上是通过影响线粒体功能(Allen and Nuss, 2004)。

低毒病毒CHV1-EP713编码ORF A和ORF B两个开放阅读框，其中ORF A编码一个多聚蛋白p69，它可以自我剪切成两个蛋白p29和p40蛋白；ORFB编码一个大的多肽，迄今已知包括p48蛋白和两个比较保守的蛋白，RNA聚合酶(Pol)和解链酶(Hel)其成熟形式尚未完全明了(商巾杰和陈保善, 2009)。其中，p29蛋白功能的研究最为详细。p29蛋白是一个木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-like protease)，在体外和体内均能将ORF A编码一个多聚蛋白p69剪切成p29和p40两个蛋白(Choi et al., 1991a; 1991b)；表达p29会引起低毒病毒毒力部分下降，显著减少宿主色素形成和分生孢子形成(Craven et al., 1993); 缺失p29的低毒病毒在宿主内的累积量和垂直传播能力均显著下降(Suzuki et al., 1999; 2003)，其后的研究证明，p29抑制RNA沉默相关基因的表达(Segers et al., 2006)。用共分离的方法，Jacob-Wilk等(2006)证明，p29蛋白与源高尔基体的膜结构共定位。但关于p29的亚细胞器定位，则尚无报道。

鉴于p29蛋白功能的广泛性及转p29菌株与线粒体基因突变体表型存在相似性，我们提出假说：p29蛋白有可能与线粒体功能存在关系。本研究在成功制备p29特异抗体和高效分离板栗疫病菌线粒体的基础上，通过Western印迹实验，证明在低毒病毒感染的菌株中，p29与线粒体共定位。

1结果与分析

1.1表达载体pET-30a/p29的构建和鉴定

PCR 扩增出全长p29基因(图1)，用EcoRI和XhoI双酶切PCR产物，回收该约0.75 kb片段，与用EcoRI和XhoI双酶切回收的pET-30a连接，构建成重组质粒pET-30a/p29。重组质粒用限制酶EcoRI和XhoI双酶切，结果显示，融合质粒pET-30a/p29切下大小约5.4 kb的pET-30a的线性化质粒大小和约0.75 kb的片段(图2)。将测序结果与p29序列比对，结果显示，质粒pET-30a/p29中目的基因p29 (744 bp)的序列与p29基因有100%的同源性，且读码框没有改变，表明融合表达质粒融合质粒pET-30a/p29构建成功。

1.2 pET-30a/p29 融合蛋白的诱导表达和纯化载体

pET-30a/p29转化入大肠杆菌BL21后，经IPTG诱导，表达pET-30a/p29融合蛋白，分子量约为32.5 kD，与预期大致相符。在所用的多种温度和IPTG条件下，菌液的上清液中几乎没有检测到融合蛋白，表明所表达出的蛋白是包涵体(图3)。

1.3 Western blotting 检测p29融合蛋白

将纯化后的大肠杆菌表达的融合蛋白p29蛋白用于免疫新西兰兔。用所制备的p29兔多抗血清对大肠杆菌表达的pET-30a/p29融合蛋白、野生菌株EP155和受病毒侵染菌株EP713的总蛋白分别进行Western blotting。免疫前血清与p29融合蛋白没有反应，但p29兔多克隆抗体与p29融合蛋白起反应(图4)。p29的兔抗血清在野生菌株EP155中没有检测出条带，而在EP713菌株的总蛋白中能够检测到分子量接近29 kD的特异性蛋白条带(图5)。

将所提取的EP155和EP713线粒体用裂解液裂解，12 000 r/min离心15 min取上清进行12% SAS-PAGE电泳，用p29兔多克隆抗体进行Western blotting。其结果表明，p29兔多克隆抗体特异性地识别EP713的线粒体中的分子量接近29 kD的特异性蛋白条带，表明板栗疫病菌EP713菌株中的线粒体含有低毒病毒所编码的p29蛋白(图6)。

2讨论

Monteiro-Vitorello等(1995)所报道的EP155/mit2突变体的包括低致病力在内的生物学表型具有细胞质遗传特性，符合典型的线粒体基因突变模型。转录谱比较研究表明，发现在73个表达水平发生改变的基因中，EP155/mit2突变体和低毒病毒感染菌株二者共同上调的有42个基因，共同下调的有29个基因，只有2个基因的改变方向相反，这表明有可能是低毒病毒感染引起了线粒体机能障碍(Allen and Nuss, 2004)。本研究发现，低毒病毒编码蛋白p29定位在宿主真菌线粒体，为这一猜测提供了迄今为止最直接的证据。特别需要指出的是，155/mit2突变体和低毒病毒感染菌株二者均导致真菌的致病力下降。就这一点来说，p29定位在宿主真菌线粒体的潜在意义是巨大的。

p29是个多功能蛋白，影响宿主的多种性状。比较EP155/mit2突变体与低毒病毒感染菌株的表型，一个显著的表型差异是，EP155/mit2突变体产生了大量桔黄色色素，而受病毒感染的菌株则丧失了桔黄色色素，表明病毒感染对宿主细胞的影响不仅仅局限于对线粒体的影响。p29与高尔基体来源的膜结构共分离，表明其受到膜囊泡的运输(Jacob-Wilk et al., 2006)，而这种运输的目的地，可能不限于线粒体。此前已有研究表明，在低毒病毒感染菌株中桔黄色色素抑制与低毒力表型是两个独立的过程(Craven et al., 1993)。

尽管转p29的板栗疫病菌菌株在表型上与低毒病毒感染菌株有许多相似之处，但在真菌致病力降低的程度上，前者显然不如后者强烈(Craven et al., 1993)。这里面两种可能，一是低毒病毒编码多种蛋白，除p29之外，其它蛋白对致病力调控也有贡献，比如由ORF B编码的多肽加工而来的p48 (Chen et al., 2000)；二是此前p29转基因用的启动子是来源于板栗疫病菌gdp基因启动子，其表达强度属中等水平，远低于病毒的表达水平(Shang et al., 2008)。随着板栗疫病菌遗传操作系统的改善，例如基于crp启动子的高表达系统(唐梅等, 2011)、新的抗性筛选标记开发(蓝秀万等, 2007)和双荧光标记方法的建立(杨峰等, 2011)，将来可以更精确判断p29表达水平以及p29与其它病毒蛋白共表达对宿主真菌表型调控的贡献。

3材料与方法

3.1供试菌株

板栗疫病菌菌株 C. parasitica EP155 (ATCC No.38755)是从美国康州分离到的板栗疫病菌野生型无病毒的强毒株。C. parasitica EP713(ATCC No.52571)通过菌丝融合将法国低毒株EP713的病毒导入EP155而获得，和EP155具有相同的遗传背景，但携带低毒病毒CHV1-EP713。大肠杆菌 E. sherichiacoli DH5α购自上海普洛麦格(Promega)生物产品有限公司。原核表达载体质粒pET-30a购自Merck公司。

3.2菌株培养条件

大肠杆菌在固体LA培养基平板于37℃恒温箱倒置培养过夜, 或在液体LB培养基于37℃摇床(200 r/min)培养过夜(Sambrook and Russell, 2001)。板栗疫病菌在液体EP完全培养基(Puhalla and Anagnostakis, 1971)中25℃静止培养5d。

3.3 pET-30a/ p29载体构建

使用promega公司pfuDNA聚合酶，PCR反应体系和反应条件参考文献(Ausubel et al., 1995)，退火温度略作改动。所用引物均由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下：NF=5'-GGCGAATTC ATGGCTCAATTAAGAAAACCC-3'；NR=5'-GAACTCGAGCTATTA GCCAATCCGGGCAAGGGGATC-3'。

上游和下游引物分别引入EcoRI和XhoI酶切位点，以Choi和Nuss (1992)构建的带有低毒病毒CHV1-EP713的侵染性全长cDNA克隆pLDST为模板，PCR扩增p29基因744个核苷酸片段的编码序列，PCR 的扩增条件为: 95℃，3 min；94℃，30 s；55℃，30s；72℃，1 min，30个循环；72℃，10 min延伸。PCR产物用EcoRI/XhoI双酶切进行琼脂糖电泳，将酶切后的PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收后的酶切产物与经EcoRI/XhoI双酶切的pET-30a载体16℃连接过夜。连接产物转化细菌菌株XL-blue感受态，将提取质粒进行酶切并进行测序证实读码框正确，得到表达质粒pET-30a/p29 (图7)。

3.4 pET-30a/ p29 融合蛋白的表达

将质粒pET-30a/ p29转化大肠杆菌BL21-plyse，挑取克隆于LB+卡那霉素的培养基中37℃摇床培养约4h至菌浓度OD值约0.5~0.6时加入IPTG进行诱导蛋白表达，使其浓度为0.01 mmol/L，转入低温20℃摇床，培养3 h。然后将培养物12 000 r/min离心15 min收集菌体，用预冷的PBS磷酸盐缓冲液悬浮菌体并超声裂解细胞并按照Qiagen公司的His标签蛋白的变性条件进行纯化。

3.5 p29融合蛋白多克隆抗体的制备

选用新西兰大白兔雄兔，在免疫前采血约1 mL作为免疫前血清。将纯化的p29蛋白(2 mg/mL)与弗氏完全佐剂(Sigma公司)用乳化器乳化好后，对兔背部、大腿部进行皮多点注射；第二次免疫：第一次免疫2周后做将抗原p29蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma公司)混匀，加强免疫，兔背部、大腿部皮多点注射第二次注射1周后，采用第二次免疫的方法做第三次加强免疫。免疫后7天采少量血液检测抗体，抗体合格后从心脏大量采血。

3.6总蛋白的提取

收集用液体EP完全培养基培养5 d的EP155和EP713菌体，用吸水纸压干，液氮研磨(加适量的PVPP)溶于下列裂解缓冲液中(7.5 mol/L尿素, 2.5 mol/L硫脲, 12.5%甘油, 50 mmol/L Tris, 0.5% n-辛基葡糖苷, 6.25 mmol/L TCEP, 1.25 mmol/L蛋白酶抑制剂)，混匀后超声1 min (200 W, 工作12 s, 间隔15 s)，4℃ 20 000 g离心30 min，取上清，加入四倍体积的预冷丙酮-20℃放置1 h，14 000 r/min离心30 min，最后将沉淀真空干燥，所得干粉用上述裂解缓冲液充分溶解后，SDS-PAGE电泳检测。

3.7板栗疫病菌线粒体的提取

按已报道的丝状真菌提取线粒体方法(Diekert et al., 2001)进行操作,略作改动。操作步骤如下：将板栗疫病菌菌株接种于PDA平板上，25℃恒温箱培养2 d，转接长势良好的菌落于200 mL EP 完全培养基中，22~26℃静止培养5 d，收集菌体用0.6 mol/L MgSO4洗涤液重悬、洗涤菌丝三次。用滤纸或吸水纸将菌体吸干并称重；取0.5 g菌丝置于50 mL酶解液(每50 mL酶解液含纤维素酶, 溶菌酶和蜗牛酶(5: 3: 2)，分别为0.5 g，0.3 g和0.2 g，溶于OM缓冲液中(1.2 mol/L MgSO4, 10 mmol/L NaH2PO4, 用1 mol/L Na2HPO4调节pH值至5.8, 过滤除菌)，将菌丝打散，28℃，200 r/min摇床振荡3~4 h，制备真菌原生质体。置显微镜下观察，有较多原生质体出现时，用离心方法(4℃, 13 000 r/min, 10 min)收集原生质体。

将制备好的原生质体悬浮于4 mL预冷匀浆缓冲液中(600 mmol/L山梨苏糖醇, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF)，加入预冷的1 mm玻璃珠，剧烈振荡10 min，每震1 min，冰上放1 min，使冷却；加入等体积匀浆缓冲液，混匀。于4℃，1 500 g离心5 min以去除细胞碎片。上清液13 000 g离心15 min，沉淀线粒体，使用SEM溶液(250 mmol/L sucrose, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L MOPS, pH 7.2)重悬，再经4℃，12 000 g离心15 min。沉淀先用少量用SEM重悬，上载到用EM缓冲液(10 mmol/L MOPS, pH 7.2，1 mmol/L EDTA)制备的15%~60%的蔗糖密度梯度，在Beckman Coulter Optima XL-100K超速离心机用SW41水平转头于4℃和134 000 g下离心1 h。将离心管中蔗糖梯度32%至60%之间的组分回收后，13 000 g下离心15 min，收集线粒体沉淀，用适量SEM溶液重悬。

3.8 Western blotting检测

将表达的pET-30a/p29融合蛋白和线粒体蛋白，经12% SDS-PAGE胶分离，电转至PVDF膜上，于3% BSA (用PBS溶解)的封闭液中室温封闭1.5 h后，分别加入用封闭液稀释的兔多克隆抗体和免疫前血清，室温孵育1 h，用pH 7.4的PBS洗3次，每次5 min。将碱性磷酸酶标记的二抗anti-rabbit IgG稀释于封闭液中，室温孵育1 h后，用PBS洗3次，每次5 min，将印迹膜放入NBT/BCIP染色液中进行染色，待出现颜色后马上放入蒸馏水中终止反应。

作者贡献

本研究中，王方贞负责构建质粒pET-30a/29和撰写论文初稿；全睿、陈本勇和王金子负责表达纯化p29融合蛋白和制备兔多克隆抗体，参与修改研究论文；商巾杰负责安排和协调实验进程，修改研究论文；陈保善负责构思并设计实验，修改及定稿研究论文等工作。全体作者均已阅读并同意提交本稿。

致谢

本研究受国家自然科学基金(30130020)和广西自然科学基金基金(桂自科0229001)资助。

参考文献
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基因组学与应用生物学

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