缪炜 , 袁冬霞 , 冯立芳 , 熊杰

作者    通讯作者
基因组学与应用生物学, 2013 年, 第 32卷, 第 69 篇   
收稿日期: 1970年01月01日    接受日期: 1970年01月01日

本研究对基于原始的四膜虫rDNA表达载体(pD5H8)进行改造，以简化目的基因的克隆步骤，扩大载体的应用范围。通过事先设计好的带I-Sce I接头的特异性引物PCR扩增载体THX-HGFP中的作为绿色荧光蛋白筛选标记的HGFP结构（含细菌启动子及细菌偏好密码子组成的gfp基因），用来替代HSP702- GFP载体位于四膜虫启动子HSP70-2和终止子HSP70-1之间的真核生物密码子组成的gfp基因，构建获得含Not I-HSP70-2 5'UTR-I-Sce I-HGFP-I-Sce I-HSP70-1 3'UTR-Not I结构的中间质粒TH-HGFP，并通过Not I单酶切位点将该结构克隆至载体pD5H8中，获得带绿色荧光蛋白筛选标记及I-Sce I稀有酶切位点的四膜虫表达载体pD5H8-HGFP（>15kb）。该表达载体的使用几乎不受酶切位点限制，可通过I-Sce I稀有酶切位点可一步实现外源基因克隆。利用该改造的载体，构建GFP的四膜虫表达载体，电转四膜虫细胞后，用荧光显微镜及Western-blotting均可检测到GFP蛋白的表达。该载体使用起来方便快捷，外源基因克隆至该表达载体后电转四膜虫，在启动子HSP70-2启动下实现高效表达，可大大扩大基于原始的rDNA的四膜虫表达载体及四膜虫表达系统的应用。

绿色荧光蛋白筛选标记；稀有酶切位点；四膜虫表达载体；高效表达