张琨琨¹ , 邵敏¹ , 吴朝兴¹ , 杨丽涛^1,2,3 , 李杨瑞^1,2,3 , 邢永秀^1,2,3

1广西大学农学院, 广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 南宁, 530004; 2中国农业科学院甘蔗研究中心, 广西农业科学院农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室, 广西甘蔗遗传改良重点实验室, 南宁, 530007
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基因组学与应用生物学, 2015 年, 第 34卷, 第 80 篇   
收稿日期: 2015年01月06日    接受日期: 2015年01月30日

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基于NCBI数据库中固氮菌nifD基因的核苷酸序列，设计并合成特异性引物，以甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E为模板，通过PCR方法获得了Klebsiella variicola DX120E nifD 基因的ORF；以pET30a(+)为原核表达载体，构建重组表达质粒pET30a-nifD。将正确的重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3)，在28℃培养条件下经1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-ply-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达；通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。结果表明，本研究克隆得到甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifD 基因的ORF为1 452 bp，编码483个氨基酸；原核诱导表达后经提纯和质谱鉴定，该蛋白等电点为5.90，分子量为53.87 kD，与预期大小一致。该蛋白在原核表达系统中以包涵体的形式成功表达。利用Ni 柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白，为今后单克隆抗体的制备、蛋白质印记杂交检测(Western Bloting)等研究奠定了基础。

甘蔗；Klebsiella variicola DX120E；nifD 基因克隆；原核表达；蛋白纯化