邓仁榆 , 黄云吉 , 李亭亭 , 李成磊 , 吴琦

四川农业大学生命科学学院, 雅安, 625014
作者    通讯作者
基因组学与应用生物学, 2015 年, 第 34卷, 第 300 篇   
收稿日期: 1970年01月01日    接受日期: 1970年01月01日

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本文应用PCR扩增两翼与靶基因上下游同源含有Cmr(氯霉素抗性基因)的片段，经电击转化至E. coli K-12 MG1655中。在λRed重组系统的帮助下，通过氯霉素抗性基因两侧的同源序列在体内与narG基因发生同源重组，随后利用Cmr两端的FTP位点，通过FLP位点专一性重组将Cmr删除，获得narG基因精确敲出且不带Cmr的E.coli K-12 MG1655(ΔnarG)突变株。最后转化NO诱导的GFP(绿色荧光蛋白基因)报告基因质粒pSB1C3_B Ba_K 381001，获得具有对(亚)硝酸盐荧光应答的重组发光工程菌株K-12 MG1655 (ΔnarG)::GFP。生长曲线测定结果表明，narG基因的敲出对大肠杆菌正常生长无显著影响(P>0.05)。荧光工程菌的荧光强度对(亚)硝酸盐的应答结果表明，E. coli K-12 MG1655 (ΔnarG)::GFP对(亚)硝酸盐的敏感性相对于E. coli K-12 MG1655::GFP提高了2.5倍左右。且在0~8 µmol/L的硝酸盐浓度下符合线性关系:  ( R²=0.9683)；在0~4 µmol/L的亚硝酸盐浓度下符合线性关系:  (R²=0.9975)。本研究所构建的E. coli K-12 MG1655(ΔnarG)::GFP能够有效检测痕量(亚)硝酸盐，可为检测食品和水质中(亚)硝酸盐提供新的方法选择。

narG基因；Red重组系统；基因敲出；(亚)硝酸盐；GFP