吴福仁 , 康雪晴 , 庄园 , 吕智略 , 郑顺心 , 周素芳

广西医科大学生物化学与分子生物学教研室, 南宁, 530021
作者    通讯作者
基因组学与应用生物学, 2016 年, 第 35卷, 第 72 篇   
收稿日期: 2015年12月01日    接受日期: 2016年01月01日

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CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术，在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA (single guide RNA, sgRNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs)，从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性，我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列，我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA (sgRNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与cas9共转染之后，利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选，并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后，我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示，分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终，我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系，为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。

报告基因；基因编辑；CRISPR/Cas9；同源重组