孙蓉¹ , 罗吉¹ , 刘姗² , 唐自钟¹ , 范明亮¹ , 李成磊¹ , 陈惠¹

1四川农业大学生命科学学院, 雅安, 625014; 2攀枝花学院生物与化学工程学院, 攀枝花, 617000
作者    通讯作者
基因组学与应用生物学, 2016 年, 第 35卷, 第 439 篇   
收稿日期: 2016年06月20日    接受日期: 2016年07月19日

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本研究根据金龙胆草转录组数据库筛选获得了皂苷合成途径的一个关键酶基因-鲨烯环氧酶(SQE)。以筛选获得的基因序列，设计带有限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ位点的特异引物，通过RT-PCR方法对SQE基因进行克隆，并利用限制性内切酶和T4连接酶的共同作用，构建pET30b(+)-SQE原核表达载体，导入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中，当OD₆₀₀达到0.6时加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，最终以SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测蛋白的表达情况。结果表明本研究成功克隆了金龙胆草鲨烯环氧酶基因(CbSQE)，该基因开放阅读框为1 575 bp，编码525个氨基酸。系统发育树分析显示CbSQE与毛曼陀罗及绞股蓝SQE基因亲缘关系比较近；酶切及测序结果表明，成功构建了CbSQE基因原核表达载体；SDS-PAGE显示成功诱导表达了CbSQE融合蛋白，蛋白分子量为57 kD，与理论预测结果相符合。本研究结果为解析金龙胆草的皂苷合成途径提供了一定的理论依据。

金龙胆草；鲨烯环氧酶；克隆；原核表达