李宏伟¹ , 王吉平² , 张堤² , 张春林² , 赵文静² , 张晶² , 翟素珍²

1贵州医科大学基础医学院人体解剖学教研室, 贵阳, 550025; 2贵州医科大学基础医学院生物学教研室, 贵阳, 550025
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基因组学与应用生物学, 2016 年, 第 35卷, 第 359 篇   
收稿日期: 2016年04月10日    接受日期: 2016年05月16日

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昆虫几丁质酶是昆虫几丁质代谢不可或缺的关键酶类。本研究旨在构建美洲大蠊几丁质酶PaCht1基因原核表达载体，纯化并鉴定PaCht1重组蛋白，为后续酶活等测定奠定基础。定向克隆PaCht1基因成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上，将构建成功的pET32a-Cht1重组表达质粒导入大肠埃希菌Rosetta中，分别对诱导剂IPTG浓度和诱导时间进行优化，确定最佳诱导浓度和诱导时间，并对表达产物进行可溶性分析。表达产物经镍离子柱纯化后通过Western blot鉴定。结果表明，美洲大蠊几丁质酶PaCht1成熟肽基因编码区长1 083 bp，编码360个氨基酸。最佳诱导浓度和诱导时间分别为0.2 mmol/L和4 h。所得重组蛋白大小约60kD，与预期结果大小一致，重组蛋白主要以包涵体的形式存在。Western blot鉴定重组蛋白可与6×His-tag单克隆抗体特异性结合。说明成功构建了原核表达载体pET32a-Cht1，并诱导表达获得了重组几丁质酶蛋白。

美洲大蠊；几丁质酶基因；原核表达；蛋白纯化