生物技术作为一种绿色、经济、高效的处理工艺已被广泛应用于苯酚生产污水的处理(Bux et al., 1999; Sami et al., 2004)。针对苯酚的生物利用已有较多的文献报道，对其代谢途径也有较明确的认识(褚蓓等, 2008)；对苯酚生产污水的生物处理工艺，相关报道也进行了处理效果等的研究并取得了一定的应用(Sokół and Korpal, 2004)，但目前生物处理技术只局限于处理低浓度的含酚废水，高浓度含酚废水的生物毒性制约了这一技术的应用；对于实际苯酚废水处理过程中微生物的种群结构及优势种群的研究还鲜见报道。核糖体RNA基因的PCR扩增结合变性梯度凝胶电泳技术(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis)可对不同细菌相同长度的PCR扩增片断根据序列的不同得到分离，表征群落结构多样性和变化，与传统微生物分离培养技术相比具有快速、允许大量样品的比较研究等优势，近年来在水处理微生物群落多样性研究方面得到普遍认可和广泛应用，使人们对污水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识，研究不同工艺运行中群落微生物动态变化有助于生物处理工艺的选择、维护和高效运行。

本研究利用PCR-DGGE技术比较分析了三种不同处理工艺和运行条件下微生物种群的多样性变化，以揭示微生物的多态性及群落结构变化与工艺、苯酚去除效率等的相关性。

1结果与分析

1.1不同工艺的苯酚处理效果

表1为不同工艺在第二阶段和第三阶段对污水COD和挥发酚的去除率(%)。可以看出，连续运行工艺的处理效果好于批量工艺，且有更强的抗冲击性，尤其当进水从混合废水更换为苯酚生产废水时，其处理效果没有明显的下降。主要在于连续运行试验中，含酚废水是按照一定流量逐渐与活性污泥完全混合，变化的水质很快就被混合反应系统稀释，不会对系统造成很大影响；而在批量试验中，含酚废水瞬时加入，对活性污泥瞬时冲击更大。

1.2微生物群落分析

当各系统稳定运行至第三阶段，即直接进苯酚原废水后，从各污泥样品中提取基因组总DNA，通过用引物GC341F/534R对所提取的DNA进行PCR扩增，均获得长度约为200 bp的特异扩增片段。 通过DGGE分析比较不同处理工艺生物多样性(图1; 表2)。

由图1可知，A/O工艺的缺氧段与其好氧段、连续好氧工艺、缺氧SBR工艺的污泥相似性分别为67.4%、74.7%和60%，说明运行工艺的差异对微生物的种群结构有较大的影响。同样为缺氧的A/O工艺中的缺氧段与缺氧SBR污泥的相似性仅为60%，表明运行工艺的变化将改变活性污泥的种群结构。可见，污水处理中的生物处理工艺的选择是很重要的。同样，由图1和表2可以看出，不同工艺的条带亮度差异也很大，条带越亮表明其丰度越高，表明不同的处理工艺导致了不同的优势种群结构，其中连续流好氧体系中微生物的多样性最高，缺氧SBR的微生物多样性最低，与其多样性变化相对应的是体系中的COD和挥发酚的去除率随着多样性的上升而增加。可见，污泥中微生物的多样性与有机物的去除有一定的联系。

图2是进一步对A－O工艺不同运行阶段的DGGE图谱。由图2可以得出，缺氧段的微生物的多样性明显高于好氧段，且两体系种群结构都随水质或负荷的改变而发生变化，在一些种群消亡的同时产生一些新的种群以适应水质或负荷的变化，但水质、负荷发生变化后体系中的优势种群并没发生明显改变。表明负责污染物去除的优势微生物群落稳定存在，这为分离并构建复合微生物菌剂提供了思路。

选取好氧段中的优势种群Y1、Y2、Y3、Y4和Y5 (图2)用引物341F/534R进行DNA了扩增、测序，测序结果通过NCBI比对，结果列于表3。优势菌株不仅具有苯环的裂解功能，同时和硫素循环有关，可能和废水中存在的含硫物质有关；结合图2可以看出，不同运行条件下变形菌和δ变形菌始终保持着优势地位，而硫磺菌Y5和不可培养的Y2菌的数量因工艺的的调整出现发生一定的变化。

2讨论

选用的三套处理工艺对苯酚生产废水的COD和苯酚均有良好的去除效果，其中连续好氧工艺处理效果最佳，同时还具有较好的耐冲击力。

PCR-DGGE技术能够有效地分析环境样品中的微生物种群。利用微生物技术处理苯酚生产废水过程中，微生物的种群特性与所选择的工艺有密切关系；连续好氧体系中微生物的多样性最高，缺氧SBR的微生物多样性最低；污水中有机物的去除率与活性污泥中微生物的多样性有一定的关系。

同一种微生物处理工艺，体系中微生物的种群结构随水质或负荷的改变而发生变化，但水质、负荷发生变化后体系中的优势种群并没发生明显改变。

3材料与方法

3.1样品的采集及模拟体系的建立

混合水(苯酚生产污水及生产中排放的微污染河道水)和苯酚生产污水取自某石化公司，其水水质特征见表4。搭建了3组处理工艺，分别为连续A/O (缺氧-好氧工艺)工艺，连续好氧工艺，缺氧SBR工艺。各装置的运行参数见表5。

实验分4个阶段运行：(1)第一个阶段为污泥驯化和启动阶段(2007年7月9日~7月13日)，用生活污水：混合水=1:1作为进水；(2)第二个阶段(2007年7月14日~8月8日)：混合废水进水(河道水: 苯酚生产污水1:1)；(3)第三个阶段(2007年8月9日~9月12日)：直接用苯酚原废水进水；(4)第四个阶段为连续好氧工艺的负荷冲击试验(2007年9月13日~10月3日)，这期间进水量分别为4.5 L/d、7.5 L/d和9 L/d。

3.2水质分析

COD、NH₃-N、挥发酚等检测方法参照《水和废水监测分析方法》第4版(国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会,1992, 中国环境科学出版社, pp.1-784)。

3.3变性梯度凝胶电泳

3.3.1 DNA的提取和PCR扩增

总DNA提取参照文献(Tsai and Olson, 1991)，用通用引物GC341F (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCC-TACGGGAGGCAGCAG-3’)和 534R (5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)进行PCR扩增。反应体系为：10×Buffer 5 μL、dNTP Mix 200 mol/L，5 μL、引物各20 pmol，1 000 ng/μL ABS 1 μL、DNA模板1 μL、Taq酶0.25 U、ddH₂O加至50 μL。PCR条件为：扩增应用Touchdown模式(iCycler Thermal Cycler, BIO-RAD, 美国)：94℃预变性5 min后，94℃变性30 s，62.5℃复性30 s，以后每个循环降低复性温度0.3℃，72℃延伸40 s，计25个循环；剩下10个循环为：94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min。

3.3.2 DGGE

电泳用10%的聚丙烯酰胺凝胶(g/L)变性梯度为30%~50% (100%的变性剂中含有7 mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺)，电泳上样量为35 μL的PCR产物；电泳条件为：1×TAE电泳缓冲液，80 V恒定电压下，60℃运行10 h。溴化乙啶(EB)染色和纯水洗涤各20 min (Muyzer, 1999)。

3.4 DNA回收和测定

在紫外灯下切取DGGE胶上的优势条带，用50 μL无菌水快速洗涤后，放入30 μL无菌水中-20℃冷冻过夜，然后用60℃的热水温育10 min，待凝胶融化后，在5 000 r/min的速度下离心5 min。取样品进行PCR扩增，条件同上，引物不带GC发夹。PCR产物送交奥科生物公司测序。

3.5微生物多样性的分析

在假设每一条带代表一个物种，条带密度代表物种的丰度的前提下，按如下公式计算多样性指数(Shannon-Wiener index, H)：

其中的pi是指某个运行周期所采样品(泳道)中单一条带的强度在该样品中的所有条带总强度中所占的比率，S是某个样品(泳道)中所有条带数目总和。均匀度(E’)和相似性系数(Cs)参考文献(刘新春等, 2005)。

作者贡献

孙瑞负责实验材料收集与方法建立等工作；段佩玲和王振宇主要负责实验方案设计、实验数据分析与整理。

资助究致谢

本研究由河南省科技攻关项目(082102220014)和河南师范大学青年基金(01046400008)共同资助及合作方提供的试验水样；同时，感谢河南师范大学生命科学学院科研平台的帮助。

参考文献

Bux F., Akkinson B., and Kasan H.C., 1999, Zinc biosorption by waste activated and digested sludges, Water Sci. Technol., 39(10-11): 127-130

Chu B., Wang Y.F., Wang H.L., Ma N., Li B.J., and Liu G.S., 2008, Screening of phenol-degrading bacterial strain, Henan Shifan Daxue Xuebao (Zirankexue Ban) (Journal of Henan Normal University (Natural Science)), 36(2): 139-142 (褚蓓, 王艳芬, 王海磊, 马宁, 李冰洁, 刘国生, 2008, 降解苯酚类污染物细菌的分离筛选, 河南师范大学学报(自然科学版), 36(2): 139-142)

Liu X.C., Wu C.Q., Zhang Y., Yang M., and Li H.Y., 2005, Application of polymerase chain-denayuring gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) to the analysis of changes of microbial ecological communities in activated sludge systems, Shengtai Xuebao (Acta Ecologica Sinica), 25(4): 842-847 (刘新春, 吴成强, 张昱, 杨敏, 李红岩, 2005, PCR-DGGE法用于活性污泥系统中微生物群落结构变化的解析, 生态学报, 25(4): 842-847)

Muyzer G., 1999, DGGE/TGGE: a method for identifying genes from natural ecosystems, Curr. Opin. Microbiol., 2(3): 317-322

Sami S., Swapna T., Tewari U.K., and Iyengar L., 2004, Anoxic treatment of phenolic wastewater in sequencing batch reactor, Water Research, 38(4): 965-971

Sokół W., and Korpal W., 2004, Determination of the optimal operational parameters for a three-phase fluidized bed bioreactor with a light biomass support when used in treatment of phenolic wastewaters, Biochemical Engineering Journal, 20(1): 49-56

Tsai Y.L., Olson B.H., 1991, Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments, Appl. Environ. Microbiol., 57(4): 1070-1074