介绍

原生动物四膜虫(Tetrahymena)是一种单细胞真核模式生物，隶属于纤毛门(Ciliophora)、寡膜纲(Oligohymenophorea)、膜口目(Hymenostomatida)，游离生活在全球各地的淡水环境中，以摄取水中的细菌与其它有机质为生，迄今为止尚未发现其对人类健康造成危害。四膜虫生长快速，在合适条件下2~3 h 即可繁殖一代；四膜虫作为第一种进行无菌纯培养并且实现细胞同步化的真核细胞，相比其它模式生物或细胞系(如秀丽线虫, 鱼类和哺乳动物体细胞)，其培养简单、经济，操作精确度高和可控性强，而且可以实现工业化大规模培养，细胞密度最高可到107 个/mL (Collins and Gorovsky, 2005; Lynn and Doerder, 2012)。此外，四膜虫拥有清楚的遗传学背景和完备的基因组数据库，目前嗜热四膜虫EST 计划(Tetrahymena EST project)、嗜热四膜虫大核基因组计划(Tetrahymena macronuclear genome project)、嗜热四膜虫全基因组基因表达芯片分析平台(Tetrahymena genome-wide microarray analysis)，以及嗜热四膜虫全基因组转录组测序等工作均已完成；而且在四膜虫中已建立起一系列成熟的基因重组和细胞转染等分子生物学操作方法和技术，使得在嗜热四膜虫中进行基因敲除/ 插入、基因沉默和基因过表达等十分方便快捷(Eisen et al., 2006; Xiong et al., 2012)。这些特点使四膜虫成为一种优良的表达系统。

四膜虫细胞内有两个结构和功能迥异的细胞核，小核是生殖核，其基因组约120 Mb，在细胞生长时期沉默，但接合生殖时期发生转录，在剔除10%左右的染色体断裂序列(chromosome breakage sequence, Cbs)和内部删除序列(internally eliminated sequence, IES)并经过45次倍增后得到营养大核(Cole et al., 1997; Turkewitz et al., 2002)。但例外的是，小核中单一拷贝的15 kb长度的rDNA 在删除Cbs 和IES 后，以自身为模板进行全序列的复制而形成中间回文对称的21 kb大核rDNA，每一侧的染色体均由5.8S、17S、26S组成，其后再大量倍增至9 000~10 000 拷贝数，因此，若将异源基因整合进小核rDNA 而不影响四膜虫的正常生长和rDNA高拷贝数的维持，就能实现异源基因在四膜虫体内的高效表达(Yao and Yao, 1989)。已有研究人员对四膜虫rDNA进行改造，发现大核17S rRNA基因单个碱基G1707A的突变，会赋予四膜虫对paromomycin的耐药性，而另一个位点U1711C 的突变亦有相同效果(Spangler and Blackburn, 1985)。基于上述筛选标记，随后从四膜虫C3株系中将能够发育成正常大核所必需的小核rDNA 序列克隆下来，与细菌载体pIC19 连接，获得环状的穿梭质粒pD5H8，该质粒转染进四膜虫(B 株系)接合生殖时期发育大核的原基(anlagen)中，四膜虫rDNA会被精确的剪切下来，经复制形成回文对称结构的大核rDNA。由于供体(donor) C3株系的rDNA复制能力优于宿主B 株系，这导致在paromomycin 药物筛选作用下宿主大核rDNA被供体rDNA替换。进而发现26S 后面插入2.3kb的异源基因不会影响四膜虫的正常生长和rDNA 高拷贝数的维持，因此异源基因藉此大量倍增至9 000~10 000 倍，实现在四膜虫体内的过表达(Sweeney andYao, 1989)。迄今为止，国外已有成功利用pD5H8载体表达异源基因的报道，如多子小瓜虫的I-抗原基因(Gaertiget al., 1999)﹑恶性疟原虫的子环孢子蛋白基因(Peterson et al., 2002)﹑人的DNaseⅠ等(Weide et al., 2007)，而国内尚未见相关研究报道。

改造前的pD5H8载体上仅仅含有用于异源基因插入的NotⅠ常规酶切位点，应用常因此受限；在实际操作过程中，由于pD5H8载体长度达到13 471 bp，极易在酶切过程中发生自连现象，且无筛选标记，这导致目的基因的克隆效率非常低；此外，pD5H8载体中不包含用于异源基因完整表达所需的启动子和终止子，因此，不同异源基因在克隆进pD5H8 载体前，每次都需要重复启动子和终止子的添加步骤。

本研究对基于原始的rDNA载体pD5H8进行改造，将四膜虫内具有高效表达的HSP70-2基因启动子和HSP70-1基因的终止子整合到pD5H8 载体中；并在启动子和终止子之间插入筛选标记———绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的盒式表达结构，通过观察细菌转化子是否发绿光即可判定载体连接成功与否；同时引入两个反向互补的稀有酶切位点I-SceⅠ作为克隆位点，有效降低载体的自连现象，使得载体应用范围几乎不受酶切位点的限制。改造后的载体提高了异源基因载体构建效率，缩短了载体构建时间，极大地扩大了载体的应用范围，这为快速实现异源基因在四膜虫内的高效表达奠定了基础。

1结果与分析

1.1四膜虫表达载体pD5H8-HGFP的构建

四膜虫表达载体pD5H8比较大(13 471 bp)，其上含有较多的酶切位点，这给异源基因的导入造成了困难。为将该载体改造成含有绿色荧光蛋白筛选标记的一步法表达载体，我们对本实验室之前报道的HSP702-GFP载体进行改造(冯立芳和缪炜, 2009)，将该载体中来源于真核生物的GFP基因序列替换成THX-HGFP载体中(前期研究结果, 结果未公开)能在细菌中表达绿色荧光蛋白HGFP序列；以THX-HGFP载体为模板，采用5' 含有稀有酶切位点I-SceⅠ的引物进行PCR扩增，得到1.5 kb的HGFP序列；以HSP702-GFP载体为模板，采用5' 含有I-SceⅠ的引物进行PCR扩增，所得扩增产物(4.7 kb)与两端含有I-SceⅠ酶切位点的HGFP序列(1.5 kb)进行连接，得到长度为6.2 kb的TH-HGFP 载体(图1)。TH-HGFP载体转染进大肠杆菌后，挑选具有绿色荧光的重组子，从中提取的质粒经I-SceⅠ酶切后得到4.7 kb和1.5 kb两个片段(图2)，证明该载体构建正确。

TH-HGFP载体经PCR扩增和NotⅠ酶切，所得3.1 kb的HSP70-2 5' UTR-I-SceⅠ-HGFP-I-SceⅠ-HSP70-1 3' UTR酶切片段插入到同样经过NotⅠ酶切后的pD5H8载体(13.8 kb)中，得到16.9 kb的pD5-H8-HGFP载体(图3)。pD5H8-HGFP载体转染进大肠杆菌后，挑选具有绿色荧光的重组子，从中提取的质粒经I-SceⅠ酶切后得到15.2 kb和1.5 kb两个片段 (图4)，证明该载体构建正确。

1.2异源基因GFP 整合进四膜虫表达载体pD5H8-HGFP

为检验四膜虫表达载体pD5H8-HGFP的一步法快速构建和高效表达能力，我们以来自真核生物的GFP作为异源基因的研究对象(冯立芳和缪炜, 2009)。通过PCR扩增得到两端携带I-SceⅠ酶切位点的GFP片段，此片段经I-SceⅠ酶切后与同样经过I-Sce Ⅰ酶切而去掉了HGFP片段的四膜虫表达载体pD5H8-HGFP 相连接，得到重组载体pD5H8-GFP (图5)。该重组载体pD5H8-GFP转染进大肠杆菌后，以绿色荧光蛋白(HGFP的表达产物)作为筛选标记，挑选不发荧光的重组子即为携带表达载体pD5H8-GFP 的重组菌。从该重组菌中提取质粒，经PCR扩增(选用Y63_F/TH_R引物)得到850 bp大小的产物(图6)，而进一步的测序结果也表明序列正确，GFP为正向插入，这说明异源基因可以通过一步法快速整合到四膜虫表达载体pD5H8-HGFP 中。

1.3异源基因GFP 在四膜虫中的高效表达

从结果1.2中得到的表达载体pD5H8-GFP通过电穿孔技术转染进入接合生殖时期的嗜热四膜虫大核原基中，接着在paromomycin 药物作用下筛选得到单克隆转化子，进而采用GFP基因的特异性引物(Y-63_F/Y-64_R)对所得转化子进行PCR扩增，所得产物与GFP基因一致(约780 bp) (图7)，这说明表达载体已成功转染进入四膜虫中。

将上述四膜虫转化子和转染了质粒pD5H8空载的嗜热四膜虫在热激处理后，经由免疫印迹法检测发现，用GFP一抗可从转染了质粒pD5H8-GFP的四膜虫表达株中检测到相应大小的蛋白条带，对照组四膜虫中无相应条带(图8)，这说明克隆到表达载体pD5H8-HGFP中的异源基因GFP能够在四膜虫内成功且高效地表达相应的GFP蛋白。

进而采用荧光显微镜观察上述2组热激后的四膜虫细胞株，发现仅转染了质粒pD5H8-GFP的四膜虫发出绿色荧光，而对照组则不发光；在非热激条件下，二者均不发光(图9)。这说明整合进表达载体pD5H8-HGFP中的异源基因GFP在四膜虫内所表达的GFP蛋白是具有生物学活性的。

2讨论

由于四膜虫拥有培养简单、经济，操作精确度高和可控性强等诸多优点，许多研究学者致力于将四膜虫开发成一个新型的真核表达系统，而这其中最为重要的环节是构建一个优秀的表达载体；因此，四膜虫体内高达9 000~10 000个拷贝的rDNA顺理成章地成为表达载体的研究热点。前人将rDNA改造成的环状穿梭质粒———pD5H8，已成功用于多种真核生物的异源基因在四膜虫体内的表达(Gaertig et al., 1999; Peterson et al., 2002;Weide et al., 2007)。然而该质粒仍存在3 个显著的缺陷：(1)缺乏异源基因表达所需的通用启动子和终止子，这导致不同的异源基因在克隆进pD5H8 载体前，每次都需要重复启动子和终止子的添加步骤；(2)缺乏足够多的合适的克隆位点来引入异源基因，其上能用于异源基因插入的稀有酶切位点仅为NotⅠ，这极易导致pD5H8载体在整合异源基因的过程中发生自连现象；(3)无合适的筛选标记，重组子的筛选效率低。本文以pD5H8载体为模板，改造后的四膜虫表达载体pD5H8-HGFP不仅克服了上述缺陷，还拥有多个优点。

第一，异源基因只需一步法即可整合进四膜虫表达载体pD5H8-HGFP。构建的四膜虫表达载体pD5H8-HGFP含有来源于四膜虫热休克蛋白的HSP70-2启动子和HSP70-1终止子(冯立芳等, 2011; 冯立芳和缪炜, 2009)；异源基因只需要通过一个I-SceⅠ的酶切和连接步骤即可整合进表达载体pD5H8-HGFP 中，省却了每个异源基因都重复一次启动子和终止子的添加步骤；这极大地缩短了载体构建周期，省时、省力、省钱。

第二，表达载体pD5H8-HGFP几乎无酶切位点的限制。表达载体pD5H8中用于异源基因插入的单酶切位点为NotⅠ，这在载体构建过程中非常容易发生自连现象，因此需要增加磷酸化处理步骤以降低载体的自连背景。本文构建的表达载体pD5H8-HGFP中，在HGFP两侧引入了两个反向的识别序列长达18 bp的归位酶I-SceⅠ酶切位点，这不仅降低了载体的自连背景，而且这种稀有的酶切位点在许多生物的基因组几乎没有，从而使得表达载体pD5H8-HGFP的应用几乎不受酶切位点的限制。

第三，表达载体pD5H8-HGFP中位于I-SceⅠ酶切位点之间有一段可替换的HGFP片段，该DNA片段是GFP基因的盒式表达结构，它能在细菌内转录并拥有可视化的筛选标记，后者可作为克隆异源基因的筛选标记，这大大提高了重组子的筛选效率，降低研究人员的工作量。

第四，表达载体pD5H8-HGFP拥有高效的异源表达能力。四膜虫热休克蛋白HSP70-2基因对热激非常敏感，在39℃热激处理30 min后，该基因的表达水平即可调高82倍(冯立芳等, 2011)；四膜虫rDNA 在发育成熟的四膜虫体内有极高的拷贝数(9 000~10 000 个)，这促使改造自rDNA 的表达载体pD5H8在paromomycin药物筛选作用下的拷贝数也高达约8 450个(冯立芳和缪炜, 2009)；高效的热休克蛋白HSP70-2启动子联合大量的载体拷贝数，使得表达载体pD5H8-HGFP拥有极高的异源表达能力(图8)。

第五，表达载体pD5H8-HGFP具有环境友好、便捷可控的特征。目前在四膜虫体内用于异源基因表达的另一种载体是对其常染色体上的β-tubulin基因(BTU)进行改造，BTU基因所编码的氨基酸序列上K350M突变赋予了四膜虫对oryzalin和vinblastine药物的耐受，藉此作为筛选标记得到四膜虫异源基因表达载体pH4T2 (Gaertig et al., 1994)。在需要表达的异源基因上游添加金属硫蛋白MTT2或MTT5基因启动子，由此组成的表达盒(expression cassette)转染进pH4T2后得到重组子，在铜或镉存在条件下诱导异源基因的大量表达(Boldrin et al., 2008; Formigari et al., 2010)。但该诱导条件———重金属会污染表达产物和环境，而本文构建的表达载体pD5H8-HGFP只需热激处理即可实现异源基因的表达；此外，相对于重金属的添加和去除，温度条件的改变更为便捷可控；因此，pD5H8-HGFP是一个环境友好、便捷可控的表达载体。

综上所述，本文对四膜虫rDNA载体(pD5H8)改造后得到表达载体pD5H8-HGFP，该载体拥有一步法引物异源基因，几乎无酶切位点的限制，有效的筛选标记，高效的异源基因表达能力，以及环境友好、便捷可控等诸多优点，这对于深入开展四膜虫基因功能的过表达研究和开发异源基因在四膜虫这一真核表达系统中的应用奠定了技术基础。

3材料与方法

3.1供试材料

大肠杆菌E. coli DH5α 购买自天根生化公司，本文中所用不同交配型的野生型嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila) B2086 与CU428 株系、质粒pD5H8均由罗彻斯特大学MartinA.Gorovsky 教授馈赠，质粒THX-HGFP 和HSP702-GFP 由本实验室构建。

3.2主要试剂及培养基配方

所用限制性内切酶均购买自New England Biolabs公司和大连宝生物工程有限公司，胶回收试剂盒购买自Axygen公司，普通质粒DNA小量提取试剂盒购买自BioFlux公司，去内毒素质粒试剂盒购自Omega公司，pGEM-T载体购买自Promega公司，DNA聚合酶购买自大连宝生物工程有限公司，T4连接酶购买自New England Biolabs公司，DNA分子量标记Marker均购买自天根生化公司及大连宝生物工程有限公司，琼脂糖购买自Biowest公司，抗体购买自碧云天生物技术研究所，NC膜购买自GE公司，化学发光试剂盒购买自Thermo Scientific公司，所用引物及测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。

SPP培养基配方参考Orias等(2000)，四膜虫的饥饿培养基配方为：10 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)和10 mmol/L Hepes (pH=7.5)。

3.3 四膜虫表达载体pD5H8-HGFP的构建

3.3.1HGFP 片段的扩增

设计用于HGFP片段扩增的引物，Y-41_F：5'-GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC-3'(下划线为I-Sce Ⅰ酶切位点)。以质粒THX-HGFP为模版，PCR扩增两端带有稀有酶切位点I-SceⅠ的HGFP片段，PCR 反应体系：10×PCRBuffer2.5 μL，25 mmol/LMgCl22.5μL，10μmol/LdNTP0.5μL，10μmol/L引物各0.5 μL，LATaq 1 unit，模板0.5 μL，补ddH2O 至25 μL； PCR 反应条件：94℃2 min，中间35个循环的94℃30s， 50℃1.5 min，72℃1.5 min，最后72℃10 min 延伸。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的扩增条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA 片段，该片段长约1.5 kb。

3.3.2HSP702-GFP载体片段的扩增

设计用于HSP702-GFP 片段扩增的引物，Y-61_F：5'-CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAAAT-3' (下划线为I-Sce Ⅰ酶切位点)；Y-62_R：5'-GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAA TTATTTGTT-3' (下划线为I-SceⅠ酶切位点)。以质粒HSP702-GFP为模版，通过PCR反向扩增，以去掉HSP702-GFP载体中的GFP 基因序列。PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，10 μmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，LATaq 1 unit，模板0.5 μL，补ddH2O 至25 μL；PCR 反应条件：94℃2 min，中间35 个循环的94℃30 s，50℃5 min，72℃5 min，最后72℃10 min 延伸。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的扩增条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，该片段长约4.7 kb。

3.3.3TH-HGFP载体的构建

从步骤3.3.1中得到的HGFP片段和步骤3.3.2中得到的HSP702-GFP片段分别采用I-SceⅠ限制性内切酶进行消化，接着对酶切后的HGFP片段与HSP702-GFP片段按照3:1的摩尔比进行连接，然后将连接产物用电转染技术转化至大肠杆菌DH5α 体内，在含有100 g/mL 氨苄青霉素的LB 固体培养基上铺平板，37℃培养16 h。由于HGFP 片段含有细菌密码子偏好性组成的GFP 基因，因此挑取具有绿色荧光的菌落即为含有TH-HGFP载体的重组子。从该重组子中提取质粒，并用I-SceⅠ限制性内切酶进行消化，得到1.5 kb和4.7 kb这2个目的大小的酶切产物(图2)。

3.3.4 pD5H8-HGFP 载体的构建

TH-HGFP载体经NotⅠ酶切后，得到的pGEM-T载体骨架片段与HSP70-2 5'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR片段大小接近，在琼脂糖凝胶电泳时无法有效地将两者区分开来。由此先采用T 载体上的通用引物M13_F 和M13_R 对TH-HGFP载体进行PCR 扩增，PCR反应体系：10 ×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/LMgCl22.5μL，10μmol/LdNTP0.5μL，10μmol/L引物各0.5 μL，LATaq 1 unit，模板0.5 μL，补ddH2O 至25 μL；PCR反应条件：94℃2 min，中间35个循环的94℃30 s，50℃3.5 min，72℃5 min，最后72℃10 min延伸。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的扩增条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，该片段长约3.5 kb。接着用NotⅠ限制性内切酶对上述回收DNA片段进行消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段(HSP70-2 5'UTR-I-SceⅠ-HGFPI-SceⅠ-HSP70-1 3' UTR)，该片段长约3 kb，其两端携带NotⅠ酶切位点。

载体pD5H8用NotⅠ单酶切处理，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，该片段长约13.8 kb。由于该长片段两端的粘性末端极易发生自连，因此用小牛碱性磷酸酶(CIAP)对回收后DNA片段的5' 末端进行去磷酸化处理，以降低其自连背景。去磷酸化反应体系：10 ×CIAP Buffer 5 μL，NotⅠ酶切后的p-D5H8 片段20 μL，CIAP 1 μL，补ddH2O 至50 μL；去磷酸化反应条件：37℃水浴1 h。

将上述HSP70-2 5' UTR-I-Sce Ⅰ-HGFP- I-SceⅠ-HSP70-1 3' UTR片段与磷酸化处理后的pD5H8片段按照10:1的摩尔比进行连接，然后将连接产物用电转染技术转化至大肠杆菌DH5α 体内，在含有100 μg/mL的LB固体培养基上铺平板，37℃培养16 h后挑取具有绿色荧光的菌落即为含有pD5H8-HGFP载体的重组子。从该重组子中提取质粒，并用I-Sce Ⅰ限制性内切酶进行消化，得到1.5 kb 和15.2 kb这2个目的大小的酶切产物(图4)。

3.4含有异源基因GFP的四膜虫表达载体pD5H8-GFP构建

设计用于GFP 片段扩增的引物，Y-63_F：5'-CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC-3' (下划线为I-SceⅠ酶切位点)，Y-64_R：5'-CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT-3' (下划线为I-SceⅠ酶切位点)。以质粒HSP702-GFP 为模板，扩增两端带I-SceⅠ酶切位点的GFP片段，PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/LMgCl2 2.5 μL， 10 μmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，LA Taq 1 unit，补ddH2O至25 μL；PCR 反应条件： 94℃2 min，中间35个循环的94℃30 s，50℃1 min，72℃1 min，最后72℃10 min 延伸。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的扩增条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，该片段长约750 bp。接着用I-SceⅠ限制性内切酶对上述回收DNA 片段进行消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA 片段(GFP)，其两端携带I-Sce Ⅰ酶切位点。从步骤3.3得到的pD5H8-HGFP载体用I-SceⅠ单酶切处理，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带切胶回收后经胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，该片段长约15.4 kb。将上述携带I-SceⅠ酶切位点的GFP 片段与之按照20:1的摩尔比进行连接，然后将连接产物用电转染技术转化至大肠杆菌DH5α 体内，在含有100 g/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基上铺平板，37℃培养16 h后挑取具有绿色荧光的菌落即为含有pD5H8-HGFP 载体的重组子。从该重组子中提取质粒，用引物Y-63_F和位于pD5H8-HGFP载体上HSP70-1终止子位置的引物TH_R： 5'-CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA-3' 进行PCR扩增，以验证GFP基因插入的方向，PCR反应体系：10×PCRBuffer 2.5μL，25 mmol/LMgCl2 2.5μL，10 μmol/LdNTP 0.5 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，模板0.5 μL， LA Taq 1 unit，补ddH2O 至25 μL；PCR反应条件： 94℃2 min，中间35个循环的94℃30 s，50℃1 min，72℃1 min，最后72℃10 min延伸，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测(图6)。

3.5含有pD5H8-GFP载体的四膜虫表达株构建

3.5.1四膜虫的接合与电击转化

四膜虫B2086、CU428株分别于30℃、150 r/min SPP培养基培养至对数生长期，1 500 r/min离心3 min回收虫体，分别用温浴(30℃)的饥饿培养基洗涤3次。将四膜虫在饥饿培养基中30℃静止饥饿，密度调整至2×105 cells/mL，饥饿18~24 h后，再将两株细胞等量混合到一起，30℃接合10 h。然后用10 mmol/L HEPES (pH 7.5)清洗一次，吸取200 μL与50 μg环状质粒DNA (OMEGA 去内毒素试剂盒所抽)混合，在0.2 cm点击杯中，用Bio-Rad 电穿孔仪进行电击，电击参数为：300 V，25 μF，50 Ω。原始的rDNA载体PD5H8的电转条件同上。

3.5.2抗性虫株的筛选

电击后室温静置1 min，然后分别将每次电击的产物加入SPP培养基中，30℃静置培养24 h，然后加入巴龙霉素至终浓度100 μg/mL。2~3 d后，观察四膜虫培养物，确定其是否成功转入了GFP的四膜虫表达载体。

3.5.3抗性虫株的Whole Cell PCR鉴定

将四膜虫培养至对数生长期，收集150~200 μL转染四膜虫细胞，倒掉上清，使细胞悬浮在80~100 μL 1×Buffer K (2 mmol/LMg2+)中，使用PCR 仪在55℃孵育1 h，99℃变性20 min 裂解；将上述裂解物置于冰上，做PCR。每25μL的体系中：上述裂解物20 μL，10×PCRBuffer 0.5 μL，MgCl2 (25 mmol/L) (终浓度为3 mmol/L) 1.4 μL，dNTP (10 μmol/L) 0.5 μL，Y-63_F (10 μmol/L) 0.5 μL，Y-64_R (10 μmol/L ) 0.5 μL，Taq 0.5 μL，加ddH2O 补至25 μL。PCR 条件：94℃2 min；94℃30 s， 50℃1 min，72℃1 min，25~35 cycles；68℃10 min。

3.6 GFP蛋白的检测

3.6.1免疫印迹法

为了使GFP蛋白的四膜虫表达株更加稳定，对PCR鉴定正确的抗性虫株将挑单克隆至巴龙霉素终浓度为200μg/mL 的SPP培养基中培养，培养至对数期后，每天转接一次，每次巴龙霉素终浓度提高200μg/mL，直到巴龙霉终浓度达到1 000 μg/mL。将巴龙霉素终浓度达到1 000 μg/mL的单克隆培养至对数期，39℃热激，处理1 h后，PBS 清洗1次，浓缩至5×107个/mL，按比例加入5×蛋白电泳缓冲液，在沸水中煮3 min，离心，取上清进行SDS-PAGE 凝胶电泳。蛋白质电泳完成后电转移至NC 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，1:1 000稀释的anti-GFP抗体4℃孵育过夜，1:5 000稀释的HRP标记的二抗室温孵育2 h。经SuperSignal化学发光底物显色液显色10 min后检测。

3.6.2荧光显微镜法

将Whole Cell PCR方法鉴定正确的GFP蛋白的四膜虫表达株的单克隆培养至对数期，一份39℃热激，处理1 h，另一份不做处理；转染了pD5H8的四膜虫也做同样的两份样品，作对照组。各取未热激处理和39℃热激处理后的1 mL 四膜虫富集至50 μL，离心条件为：1 500 r/min、30℃、2 min，然后用ZEISS显微镜在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导的四膜虫进行荧光观察，并用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录。

作者贡献

缪炜和袁冬霞设计了实验；袁冬霞承担了主要的实验工作；冯立芳﹑熊杰参与部分实验工作和论文的修改；缪炜和袁冬霞撰写了论文。

致谢

感谢罗彻斯特大学Martin A. Gorovsky教授为本研究提供了四膜虫(Tetrahymena thermophila) B2086与CU428株系、质粒pD5H8；感谢湖北大学马立新教授、钟星博士、陈亮博士、朱德武博士给予的指导和帮助；感谢对本研究成稿给予帮助的所有老师和同学！

参考文献

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