核因子κB (nucleur factor κB, NF-κB)是一种广泛存在于真核细胞内的核内转录因子，是多种信号途径的汇聚点，参与调控细胞的增殖、凋亡、分化、应激和免疫反应(曾朋等, 2007; 杨建营等, 2011; Huang et al., 2012)。在未受刺激的细胞中，NF-κB与IκB (inhibitor of NF-κB)蛋白结合，使NF-κB无法进入细胞核发挥转录因子的功能(Zhang et al., 2009; 杨建营 等, 2011)。IκB激酶(IκB kinases, IKKs)是一种丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶家族，目前发现IKKs 由具有催化活性的IKKα、IKKβ、IKKε 和没有催化活性的IKKγ 和IKAP (IKK complex-associated protein)五个成员组成。IKKs 能磷酸化IκB上的特定位点，使IκB泛素化并最终被蛋白酶体降解，解除IκB对NF-κB的抑制作用，从而使NF-κB入核发挥转录因子的功能(Xiong et al., 2008)。IKKε (IkB kinase epsilon)为IKK 家族新发现的成员之一，与较早发现的IKK 家族成员α/β 一样,在N 末端都包含一个丝氨酸/ 苏氨酸激酶结构域(李会兵, 2012)。研究发现IKKε 不仅可以通过磷酸化IκB 来激活NF-κB，在果蝇中，IKKε 过表达到一定的程度时，能够直接与IAP1 (inhibitor of apoptosis proteins 1, IAP1)结合并使之磷酸化，使IAP1 失去了抑制caspases 的能力，以间接的方式影响细胞正常形态的发生以及其它生理进程(Bergmann, 2006)。

马氏珠母贝是我国培育海水珍珠的主要贝类。已有学者对马氏珠母贝的NF-κB同源物(Wu et al., 2007; Huang et al., 2012)，IκB (Zhang et al., 2009)进行了序列分析并检测了它们在脂多糖LPS 和溶藻弧菌刺激下的反应。Xiong 等(2008)在马氏珠母贝中发现了IKK 同源物(Pf-IKK)，其序列与老鼠(mouse)的IKK-α有39%的同源性，与牡蛎(Crassostrea gigas)的IKK-α有66%的同源性。这些研究均表明在马氏珠母贝体内存在典型的NF-κB信号通路。IKKε 作为IKK 家族新发现的成员之一，在马氏珠母贝中还未见报道。本研究采用RACE 技术获得了马氏珠母贝IKKε 基因全长序列(PmIKKε)，同时利用荧光定量PCR (Realtime PCR)技术检测了PmIKKε 在马氏珠母贝六个组织中的表达量，旨在为进一步阐述NF-κB信号通路在马氏珠母贝体内各种生理进程中的作用提供理论基础。

1结果与分析

1.1 PmIKKε基因的克隆及序列分析

根据马氏珠母贝珍珠囊的转录组数据库中注释为IKKε的unigene序列设计IKKε基因的特异性引物，采用5' RACE扩增IKKε基因的5'上游序列，3'RACE扩增IKKε基因的3'下游序列，分别获得了186 bp的5'端上游序列和2 282 bp的3'端下游序列，序列经拼接后获得2 843 bp的马氏珠母贝IKKε (PmIKKε)基因cDNA全长序列(图1)。该序列5' UTR为116 bp，3' UTR 为516 bp，包含27 bp 的polyA尾巴，开放式阅读框为2 211 bp。预测其分子量为85.07 kD，等电点为6.17。

1.2 PmIKKε基因氨基酸序列分析

PmIKKε可编码737个氨基酸，软件分析结果显示PmIKKε的N端含有一个蛋白激酶功能结构域，一个MAPKK的激活位点，在C端含有一个亮氨酸拉链(leucin zipper, LZ)和一个螺旋- 环- 螺旋结构域(helix-loop-helix, HLH) (图1)。采用ClusterW5.0将马氏珠母贝的IKKε 与其它物种IKKε蛋白序列进行多序列比对分析，结果表明，各物种间的IKKε有较高的保守性，PmIKKε与牡蛎的序列相似性有45%，保守性区域多位于IKKε 蛋白N端的蛋白质激酶结构域部分。PmIKKε同已报道的马氏珠母贝IKK同源物的相似性仅为27% (图2)，说明PmIKKε与已报导的IKK同源物属于不同的IKK家族。采用MEGA5.1软件将马氏珠母贝、牡蛎、凡纳滨对虾、果蝇、罗非鱼、鼠和人的LST8蛋白序列进行聚类分析，马氏珠母贝与牡蛎聚在一起，人、鼠和罗非鱼聚在一个分支，果蝇和凡纳滨对虾聚在一个分支，聚类结果与传统的分类吻合(图3)。

1.3 PmIKKε 的组织定量分析

采用荧光定量PCR检测了马氏珠母贝IKKε基因mRNA在六个组织中的表达，结果显示，PmIKKε在马氏珠母贝的外套膜，肝胰脏、鳃、珍珠囊、闭壳肌和性腺中均有表达，但表达量存在显著性的差异，在肝胰脏中的表达显著高于其它组织，其次是性腺和鳃(图4)。

2讨论

真核生物细胞核转录因子NF-κB广泛存在于从昆虫到人类的各种生物细胞中，参与调控细胞的分化、发育、凋亡、黏附及炎症反应。IKKs在NF-κB的活化过程中发挥重要作用。当细胞受到外部信号刺激时，激活的IKKs使IκB磷酸化，磷酸化的IκB被泛素化和降解，从而使NF-κB解除了IκB的抑制作用。IKKs家族有五个组成成员：IKKα、IKKβ、IKKε和IKKγ和IKAP。在哺乳动物内，IKKε同IKKα和IKKβ有较高的相似性，在N端都有一个激酶结构域，该结构域可以磷酸化IκB，从而激活NF-κB信号通路(Peters et al., 2000)。本研究所获得的马氏珠母贝PmIKKε的N端也有一个激酶结构域，多序列比对显示该结构域在物种间具有很高的保守性，由此可见该结构域的重要性。另外，同IKKs家族成员结构一样，PmIKKε的蛋白序列的C端也含有一个LZ和一个HLH结构。LZ是介导DNA结合蛋白质和其它蛋白质结合的一种结构基元。HLH结构是由一个短的α- 螺旋通过一个环与另一个长的α- 螺旋组成的结构。HLH和LZ结构是IKK家族间形成同源或者异源二聚体的基础(Kwak et al., 2000)。这些信息表明PmIKKε的序列及结构特征与IKKs家族成员有很高的同源性。

基因在不同组织中的表达模式为研究基因功能提供参考。为进一步探讨PmIKKε在马氏珠母贝中的功能，我们分析了PmIKKε基因mRNA在马氏珠母贝六个不同组织中的表达模式。结果显示，PmIKKε在马氏珠母贝的六个组织中均有表达，以肝胰脏中的表达量最高。该研究结果说明PmIKKε在马氏珠母贝体内参与的功能比较广泛。肝胰脏是贝类免疫器官，可以分泌各种免疫酶来对抗外来物的干扰。对于没有特异性免疫的贝类来说，肝胰脏的功能显得尤为重要(Tiscar and Mosca, 2004)。研究报道，IKKε所介导的NF-κB信号通路可以诱导紫色磷酸酶和超氧化物歧化酶的表达(Darville et al., 2000;Matsumoto et al., 2001)。我们推测，在贝体受到外界刺激后，IKKε可以激活NF-κB 信号通路，促进肝胰脏分泌免疫酶来对抗外界刺激。这些结果表明，相对于的其它组织，马氏珠母贝肝胰脏可能具有较为活跃的的NF-κB信号通路，进一步证明肝胰脏在贝类先天性免疫中的重要作用。

综上所述，本研究根据马氏珠母贝转录组数据为基础，应用RACE技术获得的IKKε家族新成员PmIKKε的cDNA全长序列并对其功能进行初步的探讨。我们的研究结果证明PmIKKε在分子水平及功能上与高等生物IKK家族成员具有很高的相似性，本研究可为进一步探讨PmIKKε及其所在的NF-κB信号通路在马氏珠母贝先天性免疫中的作用奠定基础。

3材料与方法

3.1实验材料

马氏珠母贝外套膜为RACE的材料。提取成体马氏珠母贝的闭壳肌、外套膜、鳃、肝胰脏、血淋巴、性腺6个组织的总RNA为荧光定量PCR的实验材料，每个组织至少取5个平行个体。

3.2菌种与质粒

克隆载体pMD18-T Vector和感受态JM109购买于TaKaRa公司。

3.3主要试剂

LA Taq酶和RACE试剂盒(clontech)购买于TaKaRa公司，M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit和Trizol购买于Invitrogen公司，DyNAmoTM Color Flash SYBR Green qPCR Kit购买于Thermo公司，其它试剂为国产分析纯试剂。

3.4 RACE获得目的基因全长序列

根据马氏珠母贝转录组数据库中注释为IKKε的unigene序列设计IKKε基因特异性引物，5' RACE和3' RACE的操作按照clontech的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit说明书进行，将获得的目的片段分离纯化并连接到pMD18-T载体上，然后再转化到JM109感受态细胞中，通过菌落PCR挑选阳性克隆并进行测序，将测序后的序列与已知的片段进行拼接获得目的基因的cDNA全长(Jiao et al., 2012)。所用的特异性引物见表1。

3.5目的基因的生物信息学分析

用bl2seq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wbl-ast2.cgi)对测序结果及已知的unigene序列进行比对拼接，得到各基因的全长cDNA序列；ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)来预测编码框及非编码区，分子量和等电点在Expasy网站进行分析(http://web.expasy.org/compute_pi/)。

3.6实时定量PCR法检测目的基因的表达

荧光定量PCR法检测马氏珠母贝六个组织中IKKε基因mRNA的表达，beta-actin作为内参基因，采用ABI step one Software系统对荧光定量PCR结果进行分析，标本重复性及组间差异比较采用SPSS16.0进行统计。

作者贡献

杜晓东是该项目的负责人，负责指导实验的设计以及论文写作与修改；焦钰完成了本项目的实验设计、数据分析以及论文的写作与修改。王庆恒负责基因的克隆和荧光定量PCR的实验；黄荣莲和邓岳文参与了论文的修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金(31272635, 412061-41, 31372526)、广东省自然科学基金(S2012040008-042)、广东省教育厅育苗工程(2012LYM_0074)和广东海洋大学博士启动项目(1212318)共同资助。

参考文献

Bergmann A., 2006, IKK epsilon signaling: Not just NF-kappaB, Curr. Biol., 16(15): R588-R590

Darville M.I., Ho Y.S., and Eizirik D.L., 2000, NF-kappaB is required for cytokine-induced manganese superoxide dismutase expression in insulin-producing cells, Endocrinology, 141(1): 153-62

Huang X.D., Liu W.G., Guan Y.Y., Shi Y., Wang Q., Zhao M., Wu S.Z., and He M.X., 2012, Molecular cloning and characterization of class Ⅰ NF-kappaB transcription factor from pearl oyster (Pinctada fucata), Fish Shellfish Immunol., 33: 659-66

Jiao Y., Wang H., Du X., Zhao X., Wang Q., Huang R., and Deng Y., 2012, Dermatopontin, a shell matrix protein gene from pearl oyster Pinctada martensii, participates in nacre formation, Biochem. Biophys. Res. Commun., 425(3): 679-683

Kwak Y.T., Guo J., Shen J., and Gaynor R.B., 2000, Analysis of domains in the IKKalpha and IKKbeta proteins that regulate their kinase activity, J. Biol. Chem., 275(19): 14752-14759

Li H.B., 2012, IKKε expression in human gliomas and its molecular mechanisms in promoting glioma cell proliferation and invasion, Thesis for M.S., Tianjin Medical University, Supervisor: Huang Q., pp.95-103 (李会兵, 2012, IKKε 在人脑胶质瘤中的表达与其促胶质瘤细胞增殖及侵袭的分子机制研究, 硕士研究论文, 天津医科大学, 导师: 黄强, pp. 95-103)

Matsumoto M., Hisatake K., Nogi Y., and Tsujimoto M., 2001, Regulation of receptor activator of NF-kappaB ligand-induced tartrate-resistant acid phosphatase gene expression by PU.1-interacting protein/interferon regulatory factor-4, Synergism with microphthalmia transcription factor, J. Biol. Chem., 276(35): 33086-33092

Peters R.T., Liao S.M., and Maniatis T., 2000, IKK epsilon is part of a novel PMA-inducible IkappaB kinase complex, Mol. Cell, 5(3): 513-522

Tiscar P.G., and Mosca F., 2004, Defense mechanisms in farmed marine molluscs, Vet. Res. Commun., 28(Suppl 1): 57-62

Wu X., Xiong X., Xie L., and Zhang R., 2007, Pf-Rel, a Rel/nuclear factor-kappaB homolog identified from the pearl oyster, Pinctada fucata, Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai), 39: 533-539

Xiong X., Feng Q., Chen L., Xie L. and Zhang R., 2008, Cloning and characterization of an IKK homologue from pearl oyster, Pinctada fucata, Dev. Comp. Immunol., 32(1): 15-25

Yang J.Y., Xu X.F., and Xiang Z.Y., 2011, Progress in research on NF-κB, Huaihai Yiyao (Journal of Huaihai Medicine), 29(1): 93-96 (杨建营, 徐翔峰, 向珍蛹, 2011, NF-κB 的研究进展, 淮海医药, 29(1): 93-96)

Zeng P., Deng H., and Liu L.M., 2007, New member of the IkB kinases: IKKε, Shijie Huaren Xiaohua Zazhi (World Chinese Journal of Digestology), 15(33): 3524-3526 (曾朋, 邓欢, 刘亮明, 2007, IkB 激酶家族新成员: IKKε, 世界华人消化杂志, 15(33): 3524-3526)

Zhang D., Jiang S., Qiu L., Su T., Wu K., Li Y., Zhu C., and Xu X., 2009, Molecular characterization and expression analysis of the IkappaB gene from pearl oyster Pinctada fucata, Fish Shellfish Immunol., 26(1): 84-90