随着人类环保意识的上升，石油燃料所造成的污染问题越来越受到人类的重视，绿色能源成为当今研究的一个热点。其中，利用微藻生产生物柴油具有较大的优势，目前欧美多国已在此领域投入人力物力，加大研发力度。

利用微藻来生产生物柴油包括藻株选育、保种和小规模繁殖、规模化养殖、微藻采集、以及藻油和生物柴油生产等多步工艺步骤。其中优良藻种的选育十分重要。本研究工作主要集中于藻种的分离纯化与小规模繁殖上。但微藻的油脂代谢以及代谢调控领域研究基础还很薄弱。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞，带鞭毛且遗传背景较为完善的真核生物，是研究油脂代谢基因的理想藻株。

WD40结构域以甘氨酸-组氨酸开始，色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp, WD)结尾，该结构域含有约40个氨基酸。而含有此结构域的蛋白称作WD40蛋白。WD40蛋白中含有1~10个串联的WD40结构域(Simon et al., 1991)。WD40蛋白一般存在于真核生物中，具有广泛的分子和细胞生物学功能。植物中WD40蛋白调控多个发育和生化途径(Neer et al., 1994)。WD40蛋白为蛋白复合体的组装提供了平台，介导其他蛋白质互相结合。这些复合体像G蛋白、TAFII转录因子和E3泛素连接酶。已报道人类WDR5可以识别并结合到H3的N末端，WDR5可以促进组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4)甲基化(Couture et al., 2006; Han et al., 2006)。拟南芥基因组共有269个WD40基因，在酵母、果蝇和人类中都存在同源基因(van Nocker and Ludwig, 2003)。莱茵衣藻中通过以拟南芥基因为源序列进行同源搜索，发现共有100个WD40蛋白同源基因，其中Cre12.g552900在莱茵衣藻缺氮培养时，mRNA水平显著降低。由于衣藻在缺氮培养时油脂积累显著上升，该基因的下调表达，是否与油脂积累具有相关性，带着这个疑问，我们通过构建该基因RNAi干涉载体，以及构建该基因以CAMV 35S为启动子的过量表达载体，同时对该蛋白进行亚细胞定位，以下是研究结果。

1结果与分析

1.1 CrWD40基因生物信息学分析

本研究涉及的莱茵衣藻WD40蛋白在JGI基因组数据库中的local name为Cre12.g552900，NCBI GenBank的登录号为ABG33844。CrWD40基因全长1 044 bp，编码347个氨基酸残基的蛋白质，具有7个重复WD40结构域，分子式为：C₈₃₄H₁₂₉₂N₂₂₆O₂₅₆S₈，分子量为37 211.5，pI为6.94，稳定系数为22.74，属稳定蛋白质，脂肪系数90.49，属亲水性蛋白质，无跨膜结构区，通过Euk-mPLoc2.0预测的亚细胞定位于细胞质。

MEGA6.0对CrWD40聚类分析显示：CrWD40与团藻WD40蛋白同源基因的同源率为100%，与拟南芥、酿酒酵母、和水稻WD40蛋白关系较近(图1)。

图1 莱茵衣藻CrWD40与酵母, 拟南芥, 水稻, 团藻, 小麦, 玉米CrWD40同源基因聚类分析 Figure 1 Clustering analysis of CrWD40 orthologous genes in C. Reinhardtii, A. thaliana, O. sativa, V. nagariensis, T. urartu, and Z. mays

1.2 CrWD40 RNAi干涉载体的构建

通过Triol法从培养至对数生长期的莱茵衣藻CC425中提取总RNA，将得到的RNA反转录成cDNA，以此CDNA为模板进行扩增，得到CrWD40基因干涉片段序列(图2A)。CrWD40正反向片段连接中间载体T282 EcoRI酶切鉴定(图2B)。正反向片段连接干涉载体pMaa7 IR/XIR，用EcoRI对得到充足重组载体进行酶切鉴定(图2C)。将构建完成的载体命名为CrWD40-

图2 CrWD40 RNAi干涉载体构建   注: M: 2 000 Marker; A: CrWD40 RNAi干涉片段PCR扩增; B: CrWD40反向重复序列克隆进中间载体酶切鉴定,中间载体T282-CrWD40以EcoRI酶切; C: CrWD40 RNAi干涉载体构建酶切鉴定, 干涉载体pMaa7 IR/WD40IR以EcoRI酶切 Figure 2 The construction of CrWD40 RNAi interference vector Note: M: 2 000 Marker; A: RNAi fragments amplified by PCR; B: RNAi-t282 intermediate vector EcoRI digested; C: RNAi-Maa7 /XIR interfering vector EcoRI digested

1.3 CrWD40 RNAi干涉载体转化莱茵衣藻CC425及转基因藻株检测

通过生物量曲线表明，与含空白载体的转基因藻株相比较，CrWD40-RNAi转基因藻株细胞的生长较对照缓慢(图3A)。通过油脂曲线表明，相对于含空白载体的转基因藻株，CrWD40 RNAi转基因藻株体内油脂含量明显显著下降，降幅范围为11%~24% (第4天) (图3B)，说明WD40基因对莱茵衣藻体内油脂积累起着正向调控的作用。共聚焦显微镜镜检结果也明确显示CrWD40转基因藻株油脂含量下降(图3C)。为了检测上述CrWD40干涉载体对莱茵衣藻CC425体内目标基因的沉默效果，本实验采用实时荧光定量PCR方法检测CrWD40转基因藻株中CrWD40 mRNA的表达丰度(Livak and Schmittgen, 2001) (图3D)。结果显示，CrWD40 RNAi转基因藻株与对照CC425和pMaa7 IR/XIR转基因藻株比较，mRNA丰度显著下降，降幅为85%~89%，说明CrWD40被有效沉默。

图3 CrWD40 RNAi转基因藻株检测 注: A: CrWD40 RNAi转基因藻株12, 35, 59生长较对照缓慢; B: CrWD40 RNAi转基因藻株12, 35, 59油脂含量较对照显著下降, 降幅为11%~24%; C: 显微镜检显示CrWD40 RNAi转基因藻株油脂含量下降(图中亮色部分为油滴); D: CrWD40 RNAi转基因藻株mRNA丰度显著下降。实验数据利用SPSS软件做统计学分析, 显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)以*和**表示 Figure 3 The detection of CrWD40 RNAi transgenic algae Note: A: 12, 35, 59 transformants of CrWD40 growth speed had decreased; B: Oil content of transformants 12, 35, 59 had decreased 11%~24%; C: Took pictures through fluorescence microscope and it was obvious that the oil content had decreased; D: Results showed that interference effect of CrWD40 was obvious. Using SPSS statistical software to perform statistical analysis. Results was indicated as *p< 0.05, ** p< 0.01, respectively

1.4 CrWD40在莱茵衣藻中过量表达

CrWD40基因经PCR扩增后得到1 044 bp的全长片段。测序后与JGI莱茵衣藻数据库中的序列比对同源率为100%。该片段经酶切后克隆进表达载体pCAMBIA1302。采用玻璃珠法转化莱茵衣藻CC425。转基因藻株经PCR鉴定后确认有目标基因插入。转基因藻株生物量检测结果显示，与对照(pCAMBIA1302转基因藻株)相比，CrWD40过量表达转基因藻株生物量增加了16.3%~25.6% (图4A)。转基因藻株油脂含量检测结果显示，与对照相比，CrWD40过量表达转基因藻株第四天油脂含量增加了14.3%~75% (图4B)。此实验结果与通过RNAi测得的实验结果可以互补验证，CrWD40基因促进莱茵衣藻油脂的积累。显微观察结果也证明了转基因藻株油脂含量增加(图4C)。转基因藻株CrWD40 mRNA的丰度检测结果显示，CrWD40 RNAi转基因藻株与对照比较，mRNA丰度提高了770%~850% (图4D)，说明CrWD40基因过量表达。

图4 CrWD40基因过表达藻株积累 注: A: CrWD40过量表达转基因藻株27, 43, 86生长较对照迅速; B: CrWD40过量表达转基因藻株27, 43, 86油脂含量较对照显著升高, 升幅为14.3%~75%; C: 显微镜检显示CrWD40过量表达转基因藻株油脂含量增加(图中亮色部分为油滴); D: CrWD40过量表达转基因藻株27, 43, 86 mRNA丰度增加了770%~850%。实验数据利用SPSS软件做统计学分析, 显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)以*和**表示 Figure 4 The detection of CrWD40 overexpression transgenic algae Note: A: The 27, 43, 86 overexpression transformants of CrWD40 growth speed had increased; B: Oil content of overexpression transformants 27, 43, 86 had increased14.3%~75%; C: Took pictures through fluorescence microscope and it was obvious that the oil content has increased; D: Results showed that overexpression of CrWD40 was obvious. Using SPSS statistical software to perform statistical analysis. Results was indicated as *p<0.05, ** p<0.01, respectively

2讨论

WD40蛋白家族的功能范畴非常广泛，而且它具有一定的选择性，在不同的生理生化过程中与不同的蛋白质相互作用而发挥作用(Ullah et al., 2003; Baudry et al., 2004; Dixon et al., 2005; Ramsay and Glover, 2005)。目前尚未见到WD40家族蛋白调控油脂代谢的报道，本研究通过对莱茵衣藻WD40家族中一个基因Cre12.g552900进行基因敲除和基因过量表达的遗传学实验，结果显示CrWD40正向调控油脂积累。目前微藻油脂代谢调控是近期研究的热点。但报道的基因主要集中在油脂合成途径中的关键酶，如二酰甘油酰基转移酶(DGAT) (Deng et al., 2012)、磷脂酸磷酸酶(PAP) (Deng et al., 2013)、磷脂二脂酰甘油酰基转移酶(PDAT)等。它们在微藻油脂合成中起着重要的作用，但有关调节基因报道较少。目前，在莱茵衣藻JGI数据库WD40家族蛋白有多达100个，这些基因无疑参与了藻细胞的各种生理生化功能，而同源基因是否都在油脂代谢中发挥功能，目前的报道是WD40蛋白通过与MYB蛋白和bHLH蛋白形成复合体的方式起到调控作用，所以我们下一步的工作是通过酵母双杂交技术找出与CrWD40相互作用、共同调节油脂代谢的MYB和bHLH蛋白。为调节微藻油脂改良、转基因良种培育实践应用中打下基础。

3材料与方法

3.1藻株菌株及培养条件

莱茵衣藻CC425购自美国杜克大学，将CC425藻株接到HSM液体培养基中(培养条件为200 r/min, 温度24℃, 光照强度为110 μmol•m^-2•s^-1)培养至对数生长期。T282载体由本实验室自己合成，干涉载体pMaa7/XIR购于Duke大学。

3.2 WD40基因生物信息学分析

莱茵衣藻WD40基因多序列比对和聚类分析利用ClustalX 2.1和MEGA6软件完成。MAPK蛋白分子量及等电点的预测通过EXPASy pI/Mw完成(http://web.expasy.org/compute_pi/)；蛋白结构分析通过SMART完成，并利用Euk-mPLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)进行莱茵衣藻WD40基因亚细胞定位分析。

3.3莱茵衣藻CC425总RNA的提取及反转录

莱茵衣藻CC425按照Trizol的方法提取总RNA。取OD260/280在1.8~2.0之间的样品进行RNA 纯化(沙伟等, 2015)。按照TAKARA公司cDNA合成说明书将RNA反转录为cDNA (Li et al., 2012)。

3.4莱茵衣藻WD40基因片段的克隆

根据JGI上公布的CrWD40 Cre12.g552900编码区序列，设计特异性引物如下，5'-GGGACTGACTCGCAAGAAAG-3'，5'-AGCGTTGACCTCCGTCCTAT-3'进行PCR扩增，获得目标片段。

3.5 CrWD40 RNAi干涉载体的构建

以HindⅢ和BamHⅡ双酶切得到CrWD40正向片段与以XbaⅠ和SalⅠ双酶切得到CrWD40反向片段通过载体T282进行连接，然后将正反向片段通过EcoRI酶切回收并将回收片段与表达载体pMaa7IR/XIR进行连接，得到莱茵衣藻WD40干涉载体CrWD40 RNAi。

3.6 CrWD40全长基因克隆及过量表达载体构建

提取莱茵衣藻总RNA，反转录成cDNA，以此为模板，ATTTTTCAGCCATGTCA/CTCACAGGCCAATGACCT为引物，扩增CrWD40基因全长。回收扩增的目标条带，克隆进pMD18-T载体；酶切鉴定的阳性克隆，送上海生工生物公司测序。设计两端带有酶切位点的引物，CATGCCATGGTGTCAGCGGAAGTGGCGA (NcoI)/ GGACTAGTTCACAGGCCAATGACCTTC (Spe I)扩增CrWD40全长基因，回收PCR产物，以NcoI和Spe I双酶切PCR产物，克隆进pCAMBIA1302载体中。

3.7莱茵衣藻转化

采用玻璃珠法(Kindle, 1990)，将pCAMBIA1302载体转入莱茵衣藻CC425体内， 然后涂布于TAP固体培养基(5 μg/mL paromomycin; 过量表达潮霉素B (10 μg/L))上培养至莱茵衣藻生长。挑取单克隆，对其进行细胞生物量、细胞体内油脂含量和WD40基因表达丰度检测。

3.8莱茵衣藻体内油脂含量的测定

实验中油脂含量的测定采用的是酸水解法(马帅等, 2010; 国家标准GB_T 5009.6-2003)。

作者贡献

李兴涵和于俊梅是本研究的实验设计和实验研究的执行人；于俊梅和李兴涵完成数据分析，论文初稿的写作；费小雯参与实验设计，实验结果分析；邓晓东是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由海南省重大科技专项(ZDZX2013023-1-27)、海南省自然科学基金(313077, 314117)、海南省工程技术研究中心专项(GCZX2012004, GCZX2013004)和中央级公益性科研院所基本科研业务费(ITBB2015ZD07, ITBB2015ZD03)共同资助。

参考文献

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