河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为我国特有的小型淡水底栖肉食性经济鱼类][(伍汉霖等, 1993)，目前对河川沙塘鳢的研究主要集中在选育种和养殖等方面(张君等, 2011; 张丽娟等, 2013; Zhu et al., 2014)，对其免疫相关基因和抗病因子的研究未见报道。因此，开展河川沙塘鳢的免疫相关基因(因子)研究，初步了解其免疫应答机制，对河川沙塘鳢病害防治和开辟河川沙塘鳢抗病育种新途径具有重要意义。

机体的先天性免疫依赖有限的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)去识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，例如脂多糖LPS (lipopolysaccharide)和病毒型核苷酸(viral nucleic acids) (Janeway and Medzhitov, 2002)。目前被鉴定的模式识别受体主要有两大类：胞质型模式识别受体(Cytosolic PRRs)和膜结合Toll样受体(membrane-bound toll-like receptors, TLRs) (Akira et al., 2006)。

目前已发现13种TLR，TLRs可以识别多种来自细菌、病毒、真菌甚至原生动物的PAMPs，诱导促炎因子和Ⅰ型干扰素的表达从而触发免疫应答(Medzhitov, 2001; Takeda and Akira, 2005; Kawai and Akira, 2006)。TLRs在不同组织的表达存在差异，研究表明，巨噬细胞主要表达TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7和TLR9 (Muzio et al., 2000; Takeuchi et al., 2002)，尽管在不同的树突状细胞(dendritic cells, DC)亚群中有着细微的表达差别，但DC几乎表达所有的TLRs (Muzio et al., 2000)。所有TLRs都含有一个胞内TIR (Toll/IL-1 receptor)结构域，TIR结构域通过募集一个或者多个含有TIR结构域的连接蛋白将信号下传(Sousa, 2004)。具有TIR结构域的连接蛋白包括髓样分化因子(MyD88)，包含Toll/IL-1的接头蛋白(TIRAP)和包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白(TRIF) (Medzhitov et al., 1998; Oshiumi et al., 2003; Sousa, 2004; O'Neill and Bowie, 2007; Fitzgerald et al., 2001)，其中MyD88介导除TLR3之外的所有TLR信号传导(韦友传等, 2011)，TLRs信号传道通路可以大体分MyD88依赖型信号通路和TRIF依赖型信号通路(又叫做MyD88非依赖型信号通路)。不论是MyD88依赖型信号通路还是TRIF依赖型信号通路都会激活至少三种以上重要的下游分子NF-信号、MAPKs (mitogen-activated protein kinases)和IRFs (Yamamoto et al., 2003; Colonna, 2007)。

从Sangrado-vegas等(2000)分离鉴定了IL-1受体(IL-IR)，即虹鳟(Onchorynchus mykiss) IL-IR开始，各国学者开始了对鱼类TLR的研究。通过对鱼类基因组序列的挖掘，分离和鉴定出的TLR家族成员有TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、TLR13、TLR14、TLR18、TLR19、TLR20、TLR21、TLR22、TLR23。研究表明，TLR2可能对革兰氏阳性、阴性细菌及病毒都有识别作用，是 TLRs家族中识别病原体相关分子模式的能力最强的分子之一。

本研究拟通过分子生物学技术方法，利用RACE技术获得河川沙塘鳢的TLR2基因全长序列，通过生物信息学方法对其进行分析，并对河川沙塘鳢TLR2基因的组织分布及表达模式进行系统分析，为进一步揭示河川沙塘鳢免疫抗感染机制奠定理论基础。

1结果与分析

1.1 TLR2基因cDNA全长序列特征

根据从河川沙塘鳢转录组中获得的TLR2基因部分序列，利用RACE技术扩增得到TLR2基因的5’端序上游序列和3’端下游序列，通过软件拼接得到3 473 bp (GenBank登录号: KP973949) 的cDNA全长序列，包括2 631 bp开放阅读框(ORF)、75 bp的5' UTR区和767 bp的3' UTR区，并且具有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和26 bp的polyA尾巴，推测该序列编码876个氨基酸(图1)。

图1河川沙塘鳢TLR2 cDNA序列及推导的氨基酸序列 注: 推导的氨基酸序列显示在核苷酸序列下方, 为大写字母; 星号表示终止密码子; 灰色阴影部分表示结构域; 双下划线表示poly (A)尾巴 Figure 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of O. potamophila TLR2 cDNA Note: Translated amino acid sequence is shown under nucleotide sequence and in bold character; The stop codon was marked by an asterisk; The domains were highlighted as shadowed areas; The signal peptide was underlined; The poly (A) signal sequence was double-underlined

1.2蛋白结构和功能预测

SMART软件分析发现，河川沙塘鳢TLR2蛋白存在符合TLR家族所重要特征的LRR基序和TIR结构域(图2)。二级结构经Predictprotein软件进行预测，结果表明河川沙塘鳢TLR2蛋白分子在第100、122、200、241、457、494、580位有7个N-糖基化位点(N-X-S/T)；在第821位有1个依赖cAMP和cGMP蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(R/K-X-X-S/T)；在第2、419、726、787、819、824位有6个蛋白激酶C磷酸化位点(S/T-X-R/K)；在102、124、153、202、291、317、322、337、413、419、478、496、678、758、790、829、840位有17个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(S/T-X-X-D/E)；在第248、387、661位有3个酪氨酸激酶磷酸化位点(R/K-X-XD/E-X-X-Y)；在第176、318、402、471、533位有5个N酰基化位点(G-E/D/R/K/H/P/F/Y/W-X-X-S/T/A/G/C/N-X)。二级结构预测结果还表明TLR2蛋白分子包括α螺旋(272个氨基酸) 31.1%，β折叠(97个氨基酸) 11.1%，β转角(507个氨基酸) 57.9%。

图2 TLR2结构域 Figure 2 Domain structure of TLR2

1.3 TLR2系统进化分析

为了进一步研究河川沙塘鳢TLR2推定的氨基酸序列和其他脊椎动物的进化关系，利用BLAST程序在线搜索与河川沙塘鳢TLR2基因同源性较高的序列，再通过MEGA5.0软件重复计算1 000次构建N-J系统发育树的方法构建了系统发育进化树(图3)。系统树中哺乳类和鸟类聚为一支，河川沙塘鳢与所有鱼类聚类为独立的分支，与鲈形目的其它种亲缘关系最近。

图3河川沙塘鳢与其他物种TLR2基因的系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of TLR2 gene from O. potamophila and other vertebrates

1.4 TLR2基因在健康河川沙塘鳢不同组织的表达特征

应用RT-PCR法检测健康河川沙塘鳢鱼体中TLR2基因在不同组织中的mRNA表达水平。结果显示，TLR2基因在检测的12种组织(肝, 脾, 肾, 肠, 鳃, 心脏, 血液, 脑, 性腺, 肌肉, 胃及鳔)中均有表达，但它们的表达量却不同。TLR2在肝、肾、肠、血液和胃中都有很高的表达水平，鳃中表达程度中等，在脾、心脏、脑、性腺、肌肉和鳔中表达水平较低(图4)。

1.5嗜水气单胞菌感染后TLR2基因表达变化

人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后，在河川沙塘鳢3种主要免疫组织(脾, 肾, 肝)中进行不同时段表达量变化的检测，结果表明，TLR2基因在脾中感染后4 h表达水平发生下降，随后的24~48 h又上升，48 h时达到顶峰，72~96 h维持在略低于24 h水平上。在肾中，感染后表达水平持续上升，且24~96 h间的表达水平比较一致。在肝组织中，感染后一直呈现上升趋势，72 h时达到顶峰，且4~96 h表达水平相差不大(图5)。

2讨论

鱼类在脊椎动物中属较低等的类群，其特异性免疫进化不完善，而非特异性免疫对病原的识别范围较广，在其免疫应答过程中具有重要作用(Aoki et al., 2008)。其中Toll样受体(TLR)是免疫过程中发挥重要作用的一种跨膜蛋白受体，通过识别病原体相关分子模式启动免疫应答，在机体非特异性免疫与特异性免疫应答中都发挥着重要的作用。团头鲂(Megalobrama amblycephala)、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)等重要经济鱼类的Toll样受体基因已相继被克隆测序(钱曦等, 2008; 苏建国等, 2009)，其在鱼类非特异性免疫方面的功能研究也日益受到重视。目前虽有许多涉及到Toll样受体基因的克隆及表达模式的研究(范泽军, 2015)，但本实验首次从构建的河川沙塘鳢cDNA文库中得到了TLR2基因的部分片段，并利用RACE技术获得这个基因的cDNA全长。

根据TLR2基因氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树，所有鱼类构成进化树的一个主要分支，哺乳类和鸟类构成另外一个主要分支，最后聚类为一支，河川沙塘鳢与鲈形目的鱼类亲缘关系较近。然而河川沙塘鳢TLR2在蛋白的N端有保守的TIR结构，C端有LRR序列，这符合哺乳动物TLR的普遍特征，暗示哺乳动物的TLR2与河川沙塘鳢TLR2很可能是同源物，拥有类似的生理功能。有研究指出LRR数目在不同的物种中有所区别，暗含功能差异(Wu et al., 2008)，河川沙塘鳢具有7个LRR基序可能有助于提高其对病原的识别能力。

经Predictprotein软件预测河川沙塘鳢TLR2蛋白的二级结构，其酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N-糖基化位点的数目都比较多，暗示其蛋白分子可能有更多的修饰变化，可能有更敏感的识别作用，有更高效的表面递呈、捕获和识别能力。

本研究应用RT-PCR技术分析了TLR2基因在健康河川沙塘鳢12种组织的表达分布情况。分析结果显示，河川沙塘鳢TLR2基因在检测的12种组织中均有表达，只是表达水平存在组织特异性。河川沙塘鳢TLR2基因在肝、肾、肠、血液中都有很高的表达水平，鳃中表达程度中等。TLR2在斑马鱼(Brachydanio rerio)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)等多种鱼类的脾脏、头肾、肝脏等组织均有表达(Hirono et al., 2004; Meijer et al., 2004; Baoprasertkul et al., 2007; Wei et al., 2011; Samanta et al., 2012)，斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus) TLR2主要表达于头肾和脾(Baoprasertkul et al., 2007)，在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的表达类似于斑点叉尾鮰(Wei et al., 2011)。TLR2普遍在免疫器官和组织中高水平表达，暗示TLR2在固有免疫中发挥重要作用。

本研究采用RT-PCR技术研究了人工感染嗜水气单胞菌后，河川沙塘鳢TLR2基因在3种主要免疫器官中的表达变化。TLR2在脾中感染后4 h表达水平发生下降，随后的24~48 h上升，48 h时达到顶峰，72~96 h维持在略低于24 h水平上，这与斑点叉尾鮰感染爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)后TLR2的表达变化相一致(Baoprasertkul et al., 2007)。在肾中，感染后表达水平持续上升，且24~96 h间的表达水平比较一致。在肝组织中，感染后一直呈现上升趋势，72 h时达到顶峰，其他时段表达水平相差不大。受到海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)感染8周后的斑马鱼其TLR1与TLR2在mRNA水平上的表达量在血液和淋巴组织的表达量都显著增加(Meijer et al., 2004)；牙鲆受到poly I:C和肽聚糖刺激后其外周血细胞中TLR2表达量显著上升(Hirono et al., 2004)。应用LPS和poly I:C腹腔注射斜带石斑鱼24 h后，TLR2在免疫器官中均呈显著上调(Wu et al., 2008)暗示斜带石斑鱼TLR2在病毒感染和细菌感染中发挥重要作。通过以上研究可认为鱼类TLR2基因识别PAMP的范围可能要比哺乳类TLR2更为广泛，可能对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌及病毒都有识别作用。此外，TLR2可以分别与TLRl或TLR6形成异源二聚体，可识别有出三酰基脂肽和二酰基脂肽的细微差别(Takeda and Akira, 2005)，还可与CD36和CDl4结合，扩大了识别配体的种类(Kawai and Akira, 2010)。最近研究表明鱼类的TLR2与肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan-recognition protein, PGRP)结合(Chang and Nie, 2008)，与哺乳类TLR2一样结合磷壁酸和PGN (Ribeiro et al., 2010)。可见，鱼类的TLR与哺乳动物的相应TLR似乎在功能上有所差别，TLR能与哪些配体结合，以及与哪些受体结合参与识别还有待进一步深入研究。

本研究通过分子生物学技术方法，首次克隆获得河川沙塘鳢的TLR2基因的cDNA全序列，应用生物信息学方法分析其核苷酸及氨基酸序列，并预测蛋白质的结构和功能，并对河川沙塘鳢TLR2基因的组织分布及表达模式进行系统分析，这为研究TLR2基因在河川沙塘鳢免疫体系中的进化地位及与疾病抗性的相关性，为进一步研究其生物学活性、功能和表达调控以及揭示河川沙塘鳢免疫抗感染机制奠定理论基础。

3材料与方法

3.1实验材料

一龄河川沙塘鳢，体重约30 g，由南京市水产科学研究所周岗基地提供。于实验室暂养1周，确定健康无病后开始试验。

3.2总RNA的提取及cDNA的合成  

用高纯度总RNA快速抽提试剂盒(离心柱型)提取健康河川沙塘鳢脾组织总RNA，用于RACE-PCR。提取总RNA操作过程中所用枪头和离心管均为RNase-free的产品。提取方法参照说明书进行。提取的RNA在-80℃保存。用分光光度计测定样品OD_260nm/OD_280nm比值判断RNA纯度。

根据HiScript™ 1^ST strand cDNA Synthesis kit的说明进行反转录，反应体系总共10 μL。在一个RNase-free离心管里按如下体系加入反应液(10 μL)：总RNA (1 pg~500 ng) 1 μL，4×g DNAwiperMix 2 μL，RNase-free water 5 μL，用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，42℃反应2 min。在第1步的反应管中直接加入5×qRT SuperMixⅡ 2 μL，用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，按以下程序：25℃ 10 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min进行逆转录反应。cDNA产物可在-20℃储存或立即用于qPCR反应。

3.3 TLR2基因片段的获得和全长cDNA的克隆

根据从河川沙塘鳢转录组测序的cDNA文库中筛选得到350 bp的TLR2的cDNA中间EST序列，采用Invitrogen公司的5´RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0试剂盒获得基因的5’端序列。采用Clontech公司的SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit试剂盒获得目的基因的3’端序列。克隆基因所需引物已经列出(表1)。

表1克隆基因所用引物 Table 1 Primers used for genes cloning

3.4 TLR2基因的生物信息学分析

利用BLAST对测序结果进行同源性检索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。使用DNAStar等软件统计分析序列总长，确定其开放阅读框进而预测氨基酸序列。使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)对预测到的氨基酸序列进行结构和功能的分析。使用Predict protein (https://www.predictprotein.org/)在线预测蛋白二级结构。用MEGA 5.0软件重复1 000次构建N-J系统发育树。

3.5 TLR2基因在健康河川沙塘鳢不同组织表达特异性分析

取3尾健康试验鱼的12种组织(肝, 血, 肾, 肠, 鳃, 心脏, 脾, 脑, 性腺, 肌肉, 胃及鳔)，提取总RNA后，进行反转录获得cDNA第一链。依据获得的河川沙塘鳢TLR2基因cDNA全长序列分别设计特异性引物TLR2-F/TLR2R，另外TLR2的β-actin引物为β-actinF/β-actinR (表2)。分别以12种组织的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测不同组织中mRNA的表达。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL：10 μL Faststart Universal SYBR Green Master，4 μL (5 ng/μL) cDNA模板，2 μL引物(6 mmol/L)，4 μL RNase-free water。反应条件如下：95℃ 10 min，1个循环；95℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环，4℃保存。3次重复实验以减少误差。

表2荧光定量PCR引物 Table 2 Primers used for quantitative real-time PCR

试验结果数据用2^–△△Ct法来计算目的基因的相对表达量，应用SPSS软件对实验数据进行统计分析、差异显著性检验分析。用t检验计算p值，当p<0.05时认为差异显著，p<0.01认为极显著差异。数值采用均值±标准差(Means±SE)表示。

3.6 TLR2基因应对嗜水气单胞菌感染下的mRNA表达水平分析

为进一步分析河川沙塘鳢在受到病原侵袭时不同组织中TLR2基因mRNA表达水平的变化，腹腔注射嗜水气单胞菌，嗜水气单胞菌由江苏省水生疾病防控中心提供，接种至LB培养基，28℃培养至对数生长期，离心机离心收集菌体，使用0.85%无菌生理盐水配制成细菌悬液。经预试验后调整菌液浓度为1.5×10⁸ cfu/mL。实验组腹腔注射剂量为0.2 mL/尾，对照组每尾注射相同剂量的生理盐水。分别在注射后的0 h、4 h、24 h、48 h、72 h和96 h各随机取3尾河川沙塘鳢，分别取肝、脾和肾组织提取总RNA后进行实时荧光定量PCR，方法同上。

作者贡献

尹绍武是本项目的主要负责人，也是实验设计的主要人员；于兴达和汪亚媛主要负责论文写作和部分实验操作；王佩佩负责数据处理和部分图表制作；贾秀琪负责数据分析；张国松、陈树桥和周国勤参与论文修改。全体作者都阅读并同意最终的版本。

致谢

本研究由江苏省科技支撑计划(农业)项目(BE2013441)、“江苏省六大人才高峰”高层次人才项目(2012-NY-032)、南京师范大学科技成果转化基金项目(2013-02)和江苏省2015年度普通高校研究生实践创新计划项目(SJLX15_0300)共同资助。

参考文献

Akira S., Uematsu S., and Takeuchi O., 2006, Pathogen recognition and innate immunity, Cell, 124(4): 783-801

Aoki T., Takano T., Santos M.D., Kondo H., and Hirono I., 2008, Molecular innate immunity in teleost fish: review and future perspectives, Fisheries for Global Welfare and Environment, 5th World Fisheries Congress, pp.263-276

Baoprasertkul P., Peatman E., Abernathy J., and Liu Z., 2007, Structural characterisation and expression analysis of toll-like receptor 2 gene from catfish, Fish & Shellfish Immunol., 22(4): 418-426

Chang M.X., and Nie P., 2008, RNAi suppression of zebrafish peptidoglycan recognition protein 6 (zfPGRP6) mediated differentially expressed genes involved in toll-like receptor signaling pathway and caused increased susceptibility to Flavobacterium columnare, Veterinary Immunology & Immunopathology, 124(3-4): 295-301

Colonna M., 2007, TLR pathways and IFN-regulatory factors: to each its own, European Journal of Immunology, 37(2): 306-309

Fan Z.J., Zou P.F., and Yao C.L., 2015, Toll-like receptors (TLR) and its signaling pathway in teleost, Shuisheng Shengwu Xuebao (Acta Hydrobiologica Sinica), 39(1): 173-184 (范泽军, 邹鹏飞, 姚翠鸾, 2015, 鱼类Toll样受体及其信号传导的研究进展, 水生生物学报, 39(1): 173-184)

Fitzgerald K.A., Palsson-Mcdermott E.M., Bowie A.G., Jefferies C.A., Mansell A.S., Brady G., Brint E., Dunne A., Gray P., Harte M.T., McMurray D., Smith D.E., Sims J.E., Bird T.A., and O'Neill L.A., 2001, Mal (MyD88-adapter-like) is required for toll-like receptor-4 signal transduction, Nature, 413(6851): 78-83

Hirono I., Takami M., Miyata M., Miyazaki T., Han H.J., Takano T., Endo M., and Aoki T., 2004, Characterization of gene structure and expression of two toll-like receptors from Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, Immunogenetics, 56(1): 38-46

Janeway C.J., and Medzhitov R., 2002, Innate immune recognition, Annual Review of Immunology, 20(1): 197-216

Kawai T., and Akira S., 2006, TLR signaling, Cell Death & Differentiation, 13(5): 24-32

Kawai T., and Akira S., 2010, The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on toll-like receptors, Nature Immunology, 11(5): 373-384

Medzhitov R., 2001, Toll-like receptors and innate immunity, Nature Reviews Immunology, 1(2): 135-45

Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Kopp E., Stadlen A., Chen C., Ghosh S., and Janeway Jr C.A., 1998, MyD88 is an adaptor protein in the Toll/IL-1 receptor family signaling pathways, Molecular Cell, 2(2): 253-258

Meijer A.H., Gabby Krens S.F., Medina Rodriguez I.A., He S., Bitter W., Ewa Snaar-Jagalska B., and Spaink H.P., 2004, Expression analysis of the toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish, Molecular Immunology, 40(11): 773-783

Muzio M., Bosisio D., Polentarutti N., D'Amico G., Stoppacciaro A., Mancinelli R., van't Veer C., Penton-Rol G., Ruco L.P., Allavena P., and Mantovani A., 2000, Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells, Journal of Immunology, 164(11): 5998-6004

O'Neill L.A.J., and Bowie A.G., 2007, The family of five: TIR-domain-containing adaptors in toll-like receptor signaling, Nature Reviews Immunology, 7(5): 353-364

Oshiumi H., Matsumoto M., Funami K., Akazawa T., and Seya T., 2003, TICAM-1, an adaptor molecule that participates in toll-like receptor 3-mediated interferon-beta induction, Nature Immunology, 4(2): 161-167

Qian X., Huang X.X., Hua X.M., Leng X.J., and Zhou H.Q., 2008, cDNA sequence analysis and tertiary structure prediction of toll-like receptor 3 gene from Carassius auratus gibelio, Shuichan Xuebao (Journal of fisheries of China), 32(2): 190-199 (钱曦, 黄旭雄, 华雪铭, 冷向军, 周洪琪, 2008, 异育银鲫Toll样受体3的cDNA序列分析与蛋白质高级结构预测, 水产学报, 32(2): 190-199)

Ribeiro C.M.S., Hermaen T., Taverne-Thiele A.J., Savelkoul H.F.J., and Wiegertjes G.F., 2010, Evolution of recognition of ligands from gram-positive bacteria: similarities and differences in the TLR2-mediated response between mammalian vertebrates and teleost fish, Journal of Immunology, 184(5): 2355-2368

Samanta M., Swain B., Basu M., Panda P., Mohapatra G.B., Sahoo B.R., and Maiti N.K., 2012, Molecular characterization of toll-like receptor 2 (TLR2), analysis of its inductive expression and associated down-stream signaling molecules following ligands exposure and bacterial infection in the indian major carp, rohu (Labeo rohita), Fish & Shellfish Immunology, 32(3): 411-425

Sangrador-Vegas A., Martin S.A., O'Dea P.G., and Smith T.J., 2000, Cloning and characterization of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) type II interleukin-1 receptor cDNA, European Journal of Biochemistry, 267(24): 7031-7037

Sousa C.R.E., 2004, Toll-like receptors and dendritic cells: for whom the bug tolls, Seminars in immunology, 16(1): 27-34

Su J.G., Zhu Z.Y., and Wang Y.P., 2009, cDNA cloning and characterization of toll-like receptor 3 in bluntnose black bream, Megalobrama amblycephala, Shuisheng Shengwu Xuebao (Acta Hydrobiologica Sinica), 33(5): 986-993 (苏建国, 朱作言, 汪亚平, 2009, 团头鲂Toll样受体3基因的克隆及特征研究, 水生生物学报, 33(5): 986-993)

Takeuchi O., Sato S., Horiuchi T., Hoshino K., Takeda K., Dong Z., Modlin R.L., and Akira S., 2002, Cutting edge: role of toll-like receptor 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins, Journal of Immunology, 169(1): 10-14

Takeda K., and Akira S., 2005, Toll-like receptors in innate immunity, International Immunology, 17(1): 1-14

Wei Y.C., Gao Q., Chang M.X., and Luo T.R., 2011, Cloning and expression of MyD88 gene in orange-spotted grouper Epinephelus coioides, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 30(3): 288-295 (韦友传, 高谦, 昌明先, 罗廷荣, 2011, 斜带石斑鱼MyD88基因的克隆与表达, 基因组学与应用生物学, 30(3): 288-295)

Wei Y.C., Pan T.S., Chang M.X., Huang B., Xu Z., Luo T.R., and Nie P., 2011, Cloning and expression of toll-like receptors 1 and 2 from a teleost fish, the orange-spotted grouper Epinephelus coioides, Veterinary Immunology & Immunopathology, 141(3-4): 173-182

Wu H.L., Wu X.Q., and Xie Y.H., 1993, A revision of the genus Odontobutis from China with description of a new species, Shanghai Shuichan Daxue Xuebao (Journal of Shanghai Fisheries University), 2(1): 52-61 (伍汉霖, 吴小清, 解玉浩, 1993, 中国沙塘鳢属鱼类的整理和一新种的叙述, 上海水产大学学报, 2(1): 52-61)

Wu X.Y., Xiang L.X., Huang L., Jin Y., and Shao J.Z., 2008, Characterization, expression and evolution analysis of toll-like receptor 1 gene in pufferfish (Tetraodon nigroviridis), International Journal of Immunogenetics, 35(3): 215-225

Yamamoto M., Sato S., Hemmi H., Uematsu S., Hoshino K., Kaisho T., Takeuchi O., Takeda K., and Akira S., 2003, TRAM is specifically involved in the toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway, Nat. Immunol., 4(11): 1144-1150

Zhang J., Shen S.D., Xu J.R., Han X.L., and Xu P., 2011, Study on embryonic development of Odontobutis potamophila, Danshui Yuye (Freshwater Fisheries), 41(3): 83-90 (张君, 沈颂东, 徐建荣, 韩晓磊, 许璞, 2011, 河川沙塘鳢胚胎发育的研究, 淡水渔业, 41(3): 83-90)

Zhang L.J., Zhu F., Yin S.W., Hou X.Y., and Hu Y.L., 2013, Karyotypes of Odontobutis potamophila (♀)×Odontobutis yaluensis (♂) and their hybrid progeny, Haiyang Yuye (Marine Fisheries), 35(2): 183-188 (张丽娟, 祝斐, 尹绍武, 侯新远, 胡亚丽, 2013, 河川沙塘鳢(♀)×鸭绿沙塘鳢(♂)双亲及其杂交子代的核型分析, 海洋渔业, 35(2): 183-188)

Zhu F., Luo J., Yin S.W., Zhang L.J., Hou X.Y., and Hu Y.L., 2014, Isolation and characterization of twenty-eight polymorphic microsatellite markers in Odontobutis potamophila and cross-amplification in other Gobioidei, Conservation Genetics Resources, 6(3): 601-604