特邀评述 /Invited Review
蛋白质基因组学研究中的质谱仪与生物信息学方法 
巩鹏涛1,3 
,
徐润生2 ,
方宣钧1,2,3 
,
徐润生2 ,
方宣钧1,2,3
1.东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心, 哈尔滨, 150040
2.浙江农林大学暨阳学院，暨阳国际先进技术研究中心, 诸暨, 311800
3.海南省热带农业资源开发利用研究所, 三亚, 572025
作者 通讯作者
计算分子生物学, 2015 年, 第 4 卷, 第 1 篇 doi: 10.5376/cmb.cn.2015.04.0001
收稿日期: 2015年01月11日 接受日期: 2015年02月12日 发表日期: 2015年02月20日
2.浙江农林大学暨阳学院，暨阳国际先进技术研究中心, 诸暨, 311800
3.海南省热带农业资源开发利用研究所, 三亚, 572025
作者 通讯作者
计算分子生物学, 2015 年, 第 4 卷, 第 1 篇 doi: 10.5376/cmb.cn.2015.04.0001
收稿日期: 2015年01月11日 接受日期: 2015年02月12日 发表日期: 2015年02月20日
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推荐引用：
引用格式(中文)：
巩鹏涛等, 2015, 蛋白质基因组学研究中的质谱仪与生物信息学方法, 计算分子生物学(online), 4(1): 1-12 (doi: 10.5376/cmb.cn.2015.04.0001)
引用格式(英文)：
Gong et al., 2015, The Spectrometry and Bioinformatics in the Studies of Proteogenomics, Jisuan Fenzi Shengwuxue (online), 4(1): 1-12 (doi: 10.5376/cmb.cn.2015.04.0001)
摘要
随着串联质谱的蛋白质组学技术和高通量基因组测序技术的迅速发展，大大促进了组学之间的交叉和融合，作为基因组学和蛋白组学的一个集合，蛋白质基因组学(Proteogenomics)应运而生。蛋白质基因组学的核心任务是获得足够深度和广度的蛋白质组，转录组和基因组等数据, 并将所获得的组学数据进行整合分析，以便从整体的层面进行系统生物学研究。显然，蛋白质基因组学的研究涉及到蛋白质组和基因组数据的获取及后续的交叉大数据分析。针对蛋白质基因组学的分析研究中，本文总结了质谱仪和蛋白质基因组学流程分析软件的选择，重点评述了常用的生物信息学计算工具，如PepLine 、Proteogenomic Mapping Tool InsPecT，iPiG、PGP、Peppy、Bacterial Proteogenomic Pipeline、SearchGUI、ProteoAnnotator、Genosuite 等。
关键词
蛋白质基因组学；质谱仪；蛋白质组；基因组注释；生物信息学
应用串联质谱的数据搜索蛋白质数据库，已经发展成为成熟的研究生物样本中蛋白质组成的方法。然而，如果被搜索的参考蛋白质数据库只是包含了已知的蛋白质，那么利用该方法发掘新蛋白或修饰蛋白的能力就有一定的局限。
在人类疾病的分析中，如分析癌症，异常的表达模式可能产生与疾病相关的蛋白质，而此类蛋白质在参考蛋白质数据库中是往往是不存在的(Xu and Lee, 2003)。因此，搜索常用的标准蛋白质数据，如ProtKB或Swiss-Prot等，就极可能错失那些与癌症相关的新蛋白质或修饰模式。蛋白质基因组学(Proteogenomics)分析策略的使用极大的改善了这种情况(Jaffe, 2004)。
蛋白质基因组学的分析不仅可以发现基因组上的新的编码区和修正基因正确的起始和终止位置，还可以用来鉴定真核生物普遍存在的剪切变异体。在构建人类全蛋白质组草图的研究中蛋白质基因组学发挥了重要的作用，Kim等(2014)人使用该策略发掘出了808个新的人类基因组注释，其中包括140个假基因的翻译，44个新的ORFs，106个在原有注释基因结构内部的新的编码区或外显子，110个基因/蛋白质/外显子扩展事件，198个新的蛋白质N末端和201个新的信号肽切割位点。
Zhang等人对结肠和直肠癌蛋白质基因组学研究更是表明，虽然mRNA 和蛋白质的水平有一定的相关性，但在这些组织体中蛋白质的丰度不能简单的依据DNA或RNA水平推导出来，因为有超过三分之二的相关性是不显著的(Zhang et al., 2014)。拟南芥，玉米和原核生物中，蛋白质基因组的分析也展现了良好的发展潜力(Kucharova, 2014; Castellana et al., 2014; Castellana et al., 2008)。
蛋白质基因组学的核心任务是获得足够深度和广度的蛋白质组，转录组和基因组等数据, 并将所获得的组学数据进行整合分析，以便从整体的层面进行系统生物学研究。蛋白质基因组学的研究过程中涉及到蛋白质组和基因组数据的获取的工具适合程度和复杂的分析流程及后续的交叉大数据分析(Gong et al., 2014)。本文综述了在蛋白质基因组学的研究中的质谱仪的选择和蛋白质基因组学流程分析软件的研究进展。
1蛋白质基因组学中的质谱仪的使用
目前，质谱仪种类繁多，适合蛋白质和肽段分析的质谱仪的原理可以参考已有的相关综述文献(Ahmed, 2008; Thelen and Miernyk, 2012)，表1列出了各种质谱仪的指标。从质谱的分辨率方面大致可以分为两类，低分辨率如离子阱质谱仪(ion traps)、三级四极质谱仪(triple quadrupoles)，高分辨率如飞行时间质谱仪(Q-TOF)，傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR)，轨道阱质谱仪(Orbitrap)。
| Table 1 Overview of mass spectrometers available for protein analysis (Thelen and Miernyk, 2012) |
1.1离子阱质谱仪
离子阱质谱仪，由于其具有高灵敏性和快速的扫描速度可以确保蛋白质组的高覆盖率，在蛋白质基因组学研究中使用最为广泛。然而，应用离子阱质谱仪得到的数据解析度和准确性范围在0.2~0.5 Da (200~500 ppm在1000 m/z)，存在一定的局限性。较低的灵敏度使离子阱质谱仪需要高的质量允差度(mass tolerance)，因此增加了搜索空间并降低了搜索的准确度。
另外，大多数离子阱质谱仪不具备同时存储所有的碎片离子的能力，对低质量的碎片离子覆盖率比较差，并导致最终的模糊不清的肽段分配。这一局限性已经在新的离子阱质谱仪中得到改进，例如，通过pulsed-Q解离方法。然而在与前体离子的低质量准确性结合时依然可能出现偏差，从而可能增大搜索空间并增加蛋白质数据库搜索时的错误发现率(false discovery rate) (Krug et al., 2011)。
1.2傅立叶变换离子回旋共振质谱仪与轨道阱质谱仪
高灵敏度的质谱仪器，例如FT ICR和Q-TOF都具有很好的解析度，可以达到亚-ppm级的质量灵敏度，这将可以减低搜索空间并增加蛋白质数据库搜索时的准确性。然而，高灵敏度的质谱仪存在一个缺点就是相对较低的数据获取速度，导致在分析复杂肽段混合物时的采样不足，并进而影响蛋白质组的覆盖率。
新一代的混合质谱仪则通过低解析和高解析质谱仪并用的肽段检测方法，解决这一问题。典型的实例就是线性离子阱静电场轨道阱组合质谱仪(LTQ-Orbitrip)，前体肽离子质量在轨道阱质谱仪中以高的解析度和灵敏度得到测定，而裂解后的肽在线性离子阱质谱仪中以较高的速度和灵敏性得到测定(Wenger et al., 2010)。最后得到的质谱数据不仅在肽段测序速度和质量灵敏度方面，而且在蛋白质组覆盖度和数据库搜索空间方面，取得了很好的平衡。
1.3 LTQ-Oibitrap Velos
最新型的LTQ-Oibitrap Velos质谱仪通过混合一个更快速、更灵敏的双压线性离子阱质谱系统(dual-pressure linear ion trap)和一个高灵敏度的Orbitrap质谱分析仪，在蛋白质组分析的深度和准确性方面显示出巨大的潜力。改良后的更高能的碰撞诱导解离碰撞室(higher energy collision dissociation, HCD)能确保获得高速和高质谱灵敏度的MS和MS/MS质谱，并且在质量范围内有良好的碎片离子覆盖度(Olsen et al., 2009)。该设备也适合于利用化学离子源来确保电子转移裂解(electron transfer dissociation, ETD)，这种方法可以获得更全面的多电荷离子的裂解(Wenger et al., 2010; Syka et al., 2004)，提供适合蛋白质基因组学研究使用的数据。
2蛋白质基因组学中的计算工具
由于蛋白质基因组学具有相对固定的分析流程，发展一套完整的类似基因组测序和注释的蛋白质基因组学的软件是很有必要的，这样不仅可以将基因组学和蛋白质组学完整的结合，而且方便基因组的注释(Renuse et al., 2011)。适用于串联质谱为基础的蛋白质组工具众多(Nesvizhskii, 2010)，但并不是所有都适合于蛋白质基因组学。因此，开展蛋白质基因组学的研究最早开发起来的实用工具的相关的搜索及蛋白质数据库构建相关的算法，代表性的有InsPecT (Tanner et al., 2005)，GENQUEST (Sevinsky et al., 2008)和PepSplice (Roos et al., 2007)，ABLCP (Zhou et al., 2010)，ByOnic (Bern et al., 2007)和GenomicPeptideFinder (Allmer et al., 2004)等，这些可以说是蛋白质基因组学分析的基础。但在蛋白质基因组学发展的初期，整体流程化的软件仍然很匮乏，这种情况在近几年得到一定程度的改善。
通过质谱搜索鉴定得到的肽段，如何用来重新修正和注释原基因组是这类软件工具的核心任务，表2列出一些适用于蛋白质基因组学的开放源代码工具。早期的软件主要集中在将新发现的PSMs在基因组上可视化方面，随着蛋白质基因组学分析策略在基因组注释方面展现出较高的应用价值，将蛋白质基因组学分析策略集成到基因组注释中，使其成为测序物种基因组注释的固定组成部分就成为工作的目标。因此，整个蛋白质基因组学分析流程的系统化整合工具的开发就显得方兴未艾。
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Table 2 List of tools for proteogenomic research
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2.1 PepLine
PepLine是一个将MS/MS质谱通过de novo方法鉴定的蛋白酶酶切的肽定位到基因组序列的全自动化的软件(Ferro et al., 2008)。PepLine包含三个模块：Taggor，PMMatch和PMClust。这一方法是基于在第一个模块通过四极杆飞行时间(quadrupole time-of-flight, QTOF)串联质谱获得肽序列标记(peptide sequence tags, PSTs)，在第二个模块中这些PSTs根据其比值被定位回六码框翻译的基因组序列，在第三个模块中这些比值被聚类分析以鉴定潜在的编码区。该方法在处理大数据和大度真核生物基因组方面有足够的速度，并可以用来鉴定基因的内含子和外显子结构。需要注意到的是Taggor模块是特别为QTOF串联质谱数据设定的，因此，在分析其他类型的串联质谱数据时需要使用其他程序代替Taggor模块。
2.2 Proteogenomic Mapping Tool
Proteogenomic Mapping Tool是基于Aho-Corasick字符串搜索算法的Java编程的单机版跨平台应用(Sanders et al., 2011)。与PepLine 不同，Proteogenomic Mapping Tool是利用质谱数据搜索基因组的六码框翻译数据库鉴定的独有肽段(Unique Peptides)，并将这些肽段定位回其翻译的基因组中。三个输入文件：FASTA格式的要定位回去的肽段，FASTA格式的肽段要定位回去的基因组序列和遗传密码表文件。三个输出文档：包含产生的ePSTs的FASTA格式文档，详细的制表符分隔的文本文档，主要包含ePST的在基因组上的匹配位置信息等，ePSTs的GFF3 格式文档，便于研究者快速将其导入基因组阅览器实现数据的可视化。
VESPA (Visual Exploration and Statistics to Promote Annotation)是基于Java的可互动的整合蛋白质组(肽段)和转录组数据(RNA-Seq)来注释修改原核生物基因组的单机版软件(Peterson et al., 2012)。该工具可视化基因组所有的潜在读码框，通过可查询多层次基因组信息的可视化整合来发现在某些区域的高度可能的错误注释，通过SVM技术评估酶切肽段(SVM technique evaluate proteotypic peptides, STEPP)的统计方法来对可视化的肽段进行过滤。序列可以直接通过BLAST比对公共数据库进一步分析和验证。
2.3 iPiG
iPiG (integrating peptide spectrum matches into genome browser visualizations)是基于Java的单机运行的有良好用户界面的工具，方便将鉴定的肽段在基因组阅览器中很好的可视化(Kuhring et al., 2012)。其输入三个必需文件为：mzIdentML格式或制表符分隔文本格式的PSMs文档；UCSC表格格式的参考基因组注释的文本文档和UCSC表格格式的对应氨基酸翻译的文本文档。两个可选文档是：UniProt数据库阐明蛋白质和基因匹配情况的id映射文档(id-mapping)和FASAT格式的包含用来肽段鉴定蛋白质的蛋白质组文档。其输出文档包含三个文件类型：BED (browser extensible data)，GFF3 (generic feature format version 3)和文本。iPiG 的特点就是搜集了在蛋白质鉴定过程中的信息，特别是考虑了肽段和蛋白质的匹配，保证了更加特异更加快速的肽段到基因的定位。
2.4 PGP
PGP是基于Python和C++设计服务于消息传递接口高通量的批处理集群多核工作站的并行原核生物蛋白质基因组学流程工具(Tovchigrechko et al., 2014)。串联质谱数据通过InsPecT搜索基因组六码框的翻译，随后使用PepNovo和MSGF重新计算得分。那些Pvalue值为e-10或者更好的PSMs (肽段水平发现错误率大约0.3%, 质谱发现错误率0.01%)的肽被定位回其基因组位置。使用五个ORF过滤条件对在一个ORF中的肽段进行聚合分析，过滤掉低复杂度的甘氨酸和丙氨酸组成大约70%的肽段；去除超过750 bp来自下一个编码框肽段的；过滤掉ORFs缺少一个独有定位肽段的或缺少一个完全胰蛋白酶酶切的肽段；每个蛋白质至少有两个肽段。该流程可以在多水平输出分析结果，但一般便于解析和使用的有两个：GFF格式的定位肽段文件和PSMs结果文档。
2.5 Peppy
Peppy是基于Java的可单机运行的跨平台全程自动化的蛋白质基因组学分析工具(Risk et al., 2013)。为了解决蛋白质基因组学中大尺寸基因组的计算问题，Peppy在构建基因组六码框比对数据库的时间，采用的是用户自定义的基因组分段的方法，分段的序列之间直接有120 bp的重叠。程序内建有类似Ascore的质谱清除方法(Beausoleil et al., 2006)，对质谱图谱中的峰进行过滤，同样可以减轻计算压力。Peppy的质谱匹配和得分系统有两个选项：自建的基于离子匹配，高于平均值匹配离子丰度和合适的相对b和y离子丰度可以性P-values的(Risk et al., 2013)；另外一个PSM得分系统来自Morpheus (Wenger and Coon, 2013)。Peppy程序的输入文档两个：DTA或者PKL格式的质谱数据；FASTA格式的基因组DNA或蛋白质序列数据。另外一个参数文档来设定整个流程的所有参数。
2.6 Bacterial Proteogenomic Pipeline
Bacterial Proteogenomic Pipeline是基于Java单机运行具有图形化界面的跨平台细菌蛋白质基因组学分析工具。该细菌蛋白质基因组学分析工具供包含六个可以使用命令行或Java Swing图形化界面运行的模块：Parse Protein Information模块将读取一个包含基因组读码框位置信息的FASTA格式的蛋白质库和一个包含已注释基因或蛋白质的所有信息的TSV/CSV文件，创建一个已知蛋白质的GFF3文件；Compare And Combin可选模块使用另外一个FASTA数据库作为参考选项，进一步对Parse Protein Information模块创建的GFF文档和对应的FASTA文档添加信息；Genome Parser模块依据细菌基因组序列创建六码框蛋白质数据库；Create Decoy DB可选模块用来创建诱饵数据库；Combine Identifications模块将外部搜索引擎以mzTab文档格式输入，对鉴定的PSMs进行验证和FDR过滤；Analysis模块可以对鉴定的肽段进行分析，并可视化每个肽段对应的不同的鉴定的PSMs的数目。Bacterial Proteogenomic Pipeline支持将任何鉴定搜索算法和后处理算法得到的肽段鉴定转换为mzTab格式输入，可以对不同实验条件下鉴定得到的肽段可视化和比较分析。并且所有的蛋白质和肽段信息都可以输出到GFF3格式文档中，可以利用自身模块实现可视化检验，也便于在常用的基因组阅览器上近一步分析验证。
2.7 Genosuite
Genosuite是基于Perl跨平台单机版的全自动的基于四种开源质谱肽段鉴定算法基于质谱蛋白质组数据进行原核生物蛋白质基因组学分析的流水线工具(Kumar et al., 2013)。Genosuite共包括三个组件：PPT (prokaryotic proteogenomic tool), ORFmapper和PSMplotter，具体流程如图1所示。在PPT中使用OMSSA，X!Tandem，InsPecT和MassWiz四种肽段搜索鉴定算法或任意一种组合来对基因组六码框翻译的数据库进行搜索，不同算法的组合使用提高了蛋白质组搜索时间的覆盖度，基于组合的FDR得分(Combined FDRScore) (Jones et al., 2009)来对不同算法的结果进行整合过滤。程序自动将过滤后的肽段定位回基因组和已知蛋白，那些仅仅定位到基因组翻译数据库的肽段并归类为新肽，并可以GFF的格式方便分布式注释服务器(distributed annotation system, DAS)使用。ORFmapper使用genbank文档，GFF格式或者GeneMark格式的ORF预测文档和新肽的GFF文档作为输入，用来将新肽和已存在的注释和ab initio注释进行对比，进一步将新肽分类为新蛋白质编码区(novel proteins coding region, NPCR)或者是基因模式改变。最终ORFmapper就可以分别输出产生新蛋白质的肽段文件，产生基因模式变化的肽段文件和ORFs定位到新肽的文档。ORFmapper还创建了每个肽段在基因组的基因组图谱文档，这就提供了基因组范围的肽段的可视化，HTML的文件格式也便于分析。PSMplotter程序是一个肽段质谱匹配的可视化应用，其将PPT的XML文档作为输入，生产HTML文档。在HTML中所有的来自XML文档的质谱匹配都和其PSM图片超链接，这样就可以便于对PSMs的人工验证。
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Figure 1 Schematic representation of GenoSuite workflow
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2.8 ProteoAnnotator
ProteoAnnotator是基于Java的全自动的将质谱的蛋白质组学证据整合入基因组数据库的软件流程(Kucharova and Wiker, 2014)，其具体分析流程图如图2所示。ProteoAnnotator既为终端用户如实验室科学家提供了图形化的界面，也为希望在并行环境下运行该程序的信息分析人员提供了命令行模式的分析环境。ProteoAnnotator在每个分析模块中都使用了蛋白质组学标准计划(proteomics standards initiative, PSI)规定的mzldentML 标准化数据格式用于肽和蛋白质的鉴定。mzldentML的使用使得ProteoAnnotator单个模块可以和其他分析工具整合，其输出结果可以直接提交到ProteomeXchange中心数据库(Vizcaino et al., 2014)和PRIDE (Vizcaino et al., 2013)。ProteoAnnotator使用GFF3和FASTA格式的文档作为数据库输入文档。
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Figure 2 The ProteoAnnotator workflow
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如果GFF文档已经包含FASTA格式数据的情况下，FASTA格式的蛋白质序列文档就是可选择项。ProteoAnnotator需要用户上传一个套基因组坐标(genomic coordinates)和蛋白质序列作为物种基因组的正式注释模式，并被标记为“A”套基因/蛋白质以用作进一步的分析。在某些没有正式基因组模式的测序基因组，用户应当上传一套最好质量的比如由基因预测软件预测过的基因模式，接着用户可自行决定是否按照预测基因模式质量顺序为参考上传其他的并依次标注为“B”，“C”，“D”等等。ProteoAnnotator在创建诱饵数据用于SearchGUI和预处理与后处理过程中，及在使用Omssa和X!Tandem进行MS/MS搜索中都使用了MzidLib (Ghali et al., 2013)。SearchGUI作为一个开放源工具可以在一个质谱搜索中使用不同的开放源代码的搜索引擎(Omssa, X!Tandem, MSGF+和MS-Amanda) (Vaudel et al., 2011)。ProteoAnnotaotr下游分为两个途径，因此可以提供给用户两套不同的输出文档类型：一类是提供源自正式的基因模式指定的蛋白质和肽和/或者被鉴定的不同基因模式的证据；另外一类是提供正式基因组注释在高度确信鉴定的位点上有改善提高空间的证据。目前ProteoAnnotator目前整合入Proteosuite (http://www.proteosuite.org)可视化运行。
2.9 Galaxy-P
Galaxy-P是基于Galaxy项目(http://galaxyproject.org)的多“组学”数据特别关注于质谱为基础的蛋白质组学的分析平台，在Galaxy-P的基础上，研究人员开发出了一套高度灵活和宜使用的蛋白质基因组学分析流程(Jagtap et al., 2014)。基于Galaxy-P 的蛋白质基因组学分析流程共包含大约140个处理步骤，可以归类为四个模块中，其具体分析流程图如图3所示：1、质谱数据Peaklist文件的生产和来自组装的DNA或RNA序列来源的蛋白质序列数据库的生成；2、序列数据库的搜索；3、数据过滤和可信度的分配；4、新蛋白质产物在基因组中的可视化及阐释。
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Figure 3 Overview of modules and subworkflows comprising the Galaxy-based proteogenomic analysis workflow
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Galaxy-P分析的灵活性的体现之一就是数据库构建的灵活性，使得Galaxy-P可以针对不同的样品进行不同的数据库改变。这种灵活性带来便利和针对性在研究者使用该分析流程对人类唾液的蛋白质基因组学的演示分析中得到体现。研究人员发现在PSMs搜索分析中使用人类蛋白质数据库加入人类口腔微生物的蛋白质数据库组成综合数据库，比单独使用人类蛋白质数据库要多发现两倍的新序列变异体。导致这一问题出现的原因就是：微生物序列的缺失会导致串联质谱得到的来自非宿主的肽被迫和宿主的蛋白质相匹配，增加了假阳性并迫使PSMs为得到可接受的FDR必须有一个更高的得分值，因此就降低了新肽序列可信匹配的数量。这一发现说明在进行蛋白质基因组学的研究中，在样品包含非宿主的蛋白质情况下进行的蛋白质基因组学分析，如果仅仅使用宿主的蛋白质序列进行数据库搜索，其他结果会受到很大影响。
Galaxy-P灵活性的另外一个表现就是搜索时可以使用不同的质谱数据库搜索引擎，这样可以相互验证并弥补不足。在演示分析研究中ProteinPilot和X!Tandem的使用就充分证明了这一点，另外SearchGUI (Vaudel et al., 2011)未来整合入Galaxy-P的蛋白质基因组学分析流程就更值得期待。序列数据库的搜索中，“明尼苏达两步法”的使用也可以解决蛋白质基因组分析中大蛋白质数据库所固有的挑战(Jagtap et al., 2013)。在两步法中，第一步的数据库搜索使用比较宽松的严谨度来鉴定那些最可能在样品中存在的蛋白质，组成一个比较小的蛋白质库；在第二步中对第一步产生的修正的更小蛋白质数据库和与其相匹配的质谱被施加了高度严密的条件进行二次分析，在可接受的FDR水平产生PSMs。
蛋白质基因组学分析往往依靠单个的PSMs来确定潜在的新蛋白序列，考虑到单个PSMs带来的潜在的假阳性，Galaxy-P的蛋白质基因组学分析流程中提供了多中水平的质量控制和过滤。除了在数据库搜索模块使用多个数据搜索引擎来改善结果的可信度外，在关键的第三模块中BLASTP方法的使用和自行开发的PSME (peptide spectrum match evaluation)工具是PSMs质量控制的重要一环。BLASTP中和NCBI数据库的比对可以进一步过滤掉和已知序列匹配的PSMs。PSME 不仅提供了一种可视化串联质谱图谱及其对应假定序列匹配的工具，还可以用户自行设定多种PSM质量相关的参数来对质谱进行过滤。在Galaxy-P 演示数据的分析中BLASTP的分析将9333个PSMs减少点1630个，PSME高严谨度PSM质量标准的限定更是将新肽序列匹配的数量减少到55个。
Galaxy-P的蛋白质基因组学分析流程的最后一步是通过自开发的“Peptides to GFF”工具来将肽段的氨基酸序列转换为IGV (integrated genome viewer)兼容的格式，从而实现在基因组中的可视化和阐释。新肽片段在基因组上的可视化有利于进一步的对这些肽段所对应假定新蛋白质可能性的评估分析。
虽然，基于Galaxy-P的蛋白质基因组学分析流程尽管包含大约140多个步骤，但整个流程在参数优化设定的情况下，只需要一次单击就可以完成整个流程，最要的是每个模块中的分流程都可以按需求单独自我运行。这些整个流程可以通过一个网络连接或一个保存的Galaxy流程文档而与其他人分享，和流程文档一样Galaxy-P的历史文档也可以被分享，历史文档中包含了重现整个分析流程所需要的所有的软件和各种输入与输出数据。
2.10 Proteomic-Genomic Nexus
Proteomic-Genomic Nexus是基于Java语言软件包，其设计目的是将下一代测序产生的基因组和转录组数据和蛋白质质谱产生的蛋白质组数据进行整合，该软件包的具体分析流程可见图4。
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Figure 4 The Proteomic-Genomic Nexus analysis workflow
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PG Nexus软件包含有两个主要的自主设计的工具：Samifier和Results analyser。Samifier可以将蛋白质质谱转换为SAM格式，这就可以在整合基因组学查看器(integrative genomics viewer, IGV)中同时查看基因组学，转录组学和蛋白质组学的数据。Results analyser报告肽段和蛋白质的数目和类型，并可以报告他们基于自设地订的过滤条件所对应的Mascot得分，跨越外显子直接连接的也被高亮显示，这可被用于验证蛋白质的不同剪切变异体。在分析原核生物的基因组时，PG Nexus多增加了Virtual protein generator和Virtual protein merger两个工具：Virtual protein generator用来产生基于Glimmer基因预测的Mascot序列数据；Virtual protein merger则是通过搜索起始密码子和终止密码子的两侧，重新计算那些匹配到虚拟蛋白质的肽的PG开放阅读框的位置。Nexus软件可以整合入Galaxy项目，这就极大的增强了其使用的方便性。
2.11 Neosi
Neosi是基于Java和Python 语言编程的尤其适用于分析大及复杂基因组真核生物的自动化蛋白质基因组学分析套件(Castellana et al., 2014)。Neosi最早开发的版本是使用EST 和其他的转录数据(非RNA-seq)来创建自定义数据库，使用InsPect来直接搜索可变剪切图模式库(splice graphs)，用来注释模式生物拟南芥和玉米(Castellana et al., 2010)。后期改进的Neosi包含两个套件，第一个套件SpliceDB工具主要用来创建特异的数据库用来发掘变化的基因事件(gene events)，自定制构建的数据库可以使用任意的质谱搜索引擎来搜索，但程序自身整合并推荐使用MS-GF+，MS-GF+使用一个组合的方法来为谱肽匹配(peptide spectra matches, PSMs）统计得分和赋予显著性(Kim and Pevzner, 2014)。最后Enosi的第二个套件用来分析鉴定的肽段。鉴定的肽段序列自身对新肽并不具有太多信息，有基于此Enosi将这些肽归类为已知和新的两种，并在基因组中为新肽寻找定位。这新肽的定位将和已知基因的定位相比较，并进行事件的归类，这样新肽更加可以直观的易识别。Enosi也包含自己的方法用来过滤一些不可信的事件。这样Enosi就可以自动的使用所有的质谱数据搜索自定制数据库，积累所有结果并使用错误发现率(FDR)的计算方法来鉴别PSMs，归类新肽并自动对新注释事件做出提示。这些注释事件包含了：可变剪切，新剪切，融合基因，插入，缺失，突变，翻译的非翻译区(untranslated regions, UTR)，基因边界，外显子边界，新外显子，读码框偏移，反向链，新基因。Neosi并不仅适用于真核生物，在经过特殊的流程定制后，Neosi可以适用于原核生物，并且在敏感性和特异性方面比GenoSuite更加有优势(Chapman and Bellgard, 2014)。从最早开发的相关的搜索及与数据库构建相关的算法，到将鉴定的PSMs如何在基因组上可视化，再到后期整个蛋白质基因组学分析流程的系统化整合工具的开发，蛋白质基因组学的实用工具的开发随着其自身概念及应用的发展而不断发展，详细情况见表1。虽然目前已经存在多套完整的自动化的蛋白质基因组学分析流程，然而这些流程套件还是缺少统一的标准，这些流程直接注释的准确性还缺少直接全面的分析准确性方面的比较研究，因此，在进行蛋白质基因组学分析研究中如何选取合适的分析流程还是一个难题。在今后的蛋白质基因组学的发展中，确立统一的标准化规范是一个长期的目标，也是其持续发展不可或缺的一环。把相对固定的蛋白质基因组学分析流程分解模块化，提供可以相互可以衔接的标准化接口，是今后蛋白质基因组学分析工具发展的一个方向。
作者贡献
巩鹏涛负责论文的构思，文献调研，初稿撰写及修改；徐润生负责文献阅读、整理和确认，并对论文提出修改意见；方宣钧博士负责论文写作框架的确定、全文系统修改以及最后的定稿。
致谢
本研究由海南省热带农业资源研究所微生物基因组测序及生物信息学研究项目资助。
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