丝状真菌有性产孢相关基因的研究已有较多的 报道，但具体的调控机制仍不明确。有性孢子形成的主要影响因素包括光、营养条件、空气、温度等(Dyer and Gorman, 2012)；其中，外界环境压力对产孢的影响尤其重要，已报道与胁迫应答有关的基因有esdC、 cpcA、cpcB、lsdA等(Lee et al., 2001; Scherer et al., 2002; Han et al., 2008)。esdC 基因(early sexual development) 主要在有性发育早期表达，所编码的 EsdC 蛋白在丝状真菌中是高度保守的，且含有一个糖原结合区域 (Han et al., 2008; Jeong et al., 2000)。在模式生物构巢曲霉中，ΔesdC 突变体不能形成闭囊壳，却产生大量 的分生孢子，证实 esdC 基因是有性发育阶段必需基因之一(Han et al., 2001)。对该基因进行超表达实验得出超表达并不能有效增强有性产孢；在 ΔflbA 和 ΔfadAG42R 突变体中，esdC 基因只能少量表达，甚至不表达(Yu et al., 1996)。这些结果暗示 esdC 基因是有性孢子形成必需的，且与其它基因一起构成调控网络，调节丝状真菌的有性发育过程。

谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var. in- termedius)是从茯砖茶中分离出来的优势菌种(陈晓阳, 1997, 茶叶通讯, 1: 42-43)。目前，对该菌的研究主要表现在菌种鉴定、形态观察和功能性研究等方面。我们实验室对该菌的前期研究工作表明，影响该菌产孢的主导条件是渗透压，一般情况(即低渗透压条件下)， 此菌极易产生子囊孢子，而在高渗透压下产生大量分生孢子(刘作易等, 1991, 西南农业学报, 4(1): 73-77)。这些特征表明该菌为研究有性机理的良好材料。因此，研究谢瓦氏曲霉间型变种 esdC 基因具有重要的理论价值，也为其它曲霉的有性发育分子机制提供借鉴。

1 结果与分析

1.1 谢瓦氏曲霉间型变种总 RNA 的检测

采用 1.0%普通琼脂糖凝胶电泳对提取的总 RNA进行完整度检测。如图1所示，电泳结果呈现完整的三条带，从上到下分别是 28 S、18 S 和 5.8 S，且 18 S条带亮度的 2 倍与 28 S 条带的亮度相当。因此，断定所提取的总 RNA 已符合实验标准。
 

1.2 esdC 基因片段的克隆

用引物对 esdCF 和 esdCR 扩增得到 400 bp 的片段(图2)，测序结果比对后证实为 esdC 基因的部分片段，因此将其命名为 esdC 基因。可以用于设计基因特异性引物。

1.3 esdC 基因全长 cDNA 的获得及序列分析

从图3可以看出：通过 RACE 法扩增得到 esdC 基因 3'-RACE 和 5'-RACE 端，其大小分别为 750 bp 和1 100 bp 左右。将得到的 3' 和 5' 末端片段克隆测序 后；利用 BioEdit 软件对其拼接分析，得到 esdC 基因全长 cDNA 为 1 472 bp。将序列提交到 Softberry 的 Gene Finding 工具进行序列分析，结果表明该基因含有一个开放阅读框(ORF)，长度为 819 bp，从 396 ~1 214 bp。5'端非编码区为 395 bp，3' 端非编码区为 255 bp，含有30 个腺嘌呤尾巴，预测编码 273 个氨基酸(图4)。

将 esdC 基因的序列在 NCBI (national center for biotechnology information, NCBI)上进行 BLASTn (核 苷酸序列比对)和 BLASTx (蛋白质序列比对)同源比 对，BLASTn 的结果发现：该基因与费希新萨托菌 (Neosartorya fischeri) NRRL 181 有性发育蛋白 EsdC (XM_001262829.1)同源性最高，identity=78%。其所预 测的蛋白序列也与费希新萨托菌(Neosartorya fischeri) NRRL 181 有性发育蛋白 EsdC (XM_001262829.1)的同源性最高，identity=81%，其保守区序列主要集中于 蛋白质的 N 端。将该基因序列预测的蛋白质氨基酸序 列提交到 protparam 网站上，推测该蛋白质的等电点 pI 为 9.51，分子量为 30.265 58 kD。负电荷氨基酸 (Asp+Glu)总数为 28，正电荷氨基酸(Arg+Lys)总数为 40，是一种碱性蛋白；不稳定参数为 63.54，属于不稳 定蛋白。该蛋白含有较多的亲水性氨基酸，平均疏 水性为 -0.829 670，而且没有发现跨膜螺旋结构。将 esdC 基因序列预测的蛋白质氨基酸序列提交到 Sig- nalP-4.0 进行信号肽预测，结果显示没有信号肽。 Sosui 在线软件预测为可溶性蛋白。在 wolfpsort 网站上分析该蛋白质可能位于细胞核。

2 讨论

绝大多数丝状真菌在自然条件下以产生无性孢子进行繁殖(刘静等, 2009)。因此，与无性产孢机理的 研究工作相比，人们对于有性产孢机制的研究相对缓 慢。而谢瓦氏曲霉间型变种却比较特殊，它在自然条 件下只进行有性繁殖，在高渗透压下进行无性繁殖， 是研究丝状真菌有性产孢机制的理想材料。

在构巢曲霉中，esdC 基因已被克隆，编码 266 个氨基酸，含一个 59 bp 内含子，是有性发育过程的重要调节基因(Han et al., 2008)。而且，GenBank 中的大部分 esdC 基因的开放阅读框为 798 bp，而谢瓦氏曲霉间型变种 esdC 基因的开放阅读框大小和内含子的长度与构巢曲霉略有不同。由于基因的表达具有时空性，这些结果可能导致其编码的蛋白质的功能发生变化。对 EsdC 蛋白进行 Blast 分析显示，该蛋白在曲霉中是保守的，且预测该蛋白可能调控有性产孢。正如 veA 和 nsdD，esdC 基因可能形成一个调控网络卷入有性发育(Adams et al., 1998; Kim et al., 2002; Han et al., 2001)。而该基因在谢瓦氏曲霉间型变种是否具有相同或相似的功能需要我们进一步研究。这些实验结果为进一步研究该基因的分子功能及可能参与的调控途径打下了基础。

3 材料与方法

3.1  实验材料

3.1.1 菌株

谢瓦氏曲霉间型变种 Aspergillus chevalieri var. intermedius (菌株号为 GZAAS20.1004)和大肠杆菌 E.coliDH5α 均保存于贵州省农业生物技术重点实验 室。pMD R 19-T 载体购于 TaKaRa 公司。

3.1.2 试剂

RNAiso Plus 购自 TaKaRa 公司、cDNA第一链合成试剂盒购自 Fermentas 公司、引物合成由上海捷瑞生物公司完成、2×Taq PCR MasterMix 和普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购于 Tiangen 公司、SMARTer RACE cDNA Amplication Kit 购于 Clontech 公司。MYA 培养 基：麦芽提取物 20 g，酵母粉 5 g，蔗糖 30 g，琼脂 15 g，加蒸馏水定容至 1 000 mL。

3.1.3 仪器

各种规格的移液枪(Eppendorf)、C1000TM Thermal Cycler PCR 仪(Bio-RAD)、超低温冰箱(Thermo For-ma)、5418 型离心机(eppendorf)、琼脂糖凝胶电泳仪 (安玛西亚)、SS-325 型高压灭菌锅(Tomy Kogyo)等。

3.2 实验方法

3.2.1 实验样品的准备

接种孢子悬液(浓度: 106 个 /mL) 50 μL 于 100 mL MYA 培养液中，28℃、220 r/min 培养 5~6 d 后，再将菌 丝挑出接种于 MYA 固体培养基上，28℃培养 16 h 左 右，收集菌丝。

3.2.2 总RNA 的提取

总 RNA 提取步骤参照大连宝生物公司 RNAiso Plus 试剂盒说明书进行(马权等, 2012)。

3.2.3 cDNA 第一链的合成

反转录实验步骤按照 Fermentas 公司 cDNA 第 一链合成试剂盒说明书进行。

3.2.4 esdC 基因片段的克隆

根据筛选得到的序列设计引物 esdCF (5'-CGCATCCACCACCCAAAG-3') 和 esdCR (5 '-CGCTATCTGACTCGGAGCAACT-3')，以谢瓦氏曲霉间型变种 产子囊孢子初期的总 RNA 反转录产物作为模板进行PCR 扩增，测序分析。反应体系(50 μL)：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，cDNA 模板 1 μL，esdCF 1 μL，esdCR 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 反应参数为：94℃5 min；94℃30 s，59℃ 45 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃ 10 min；12℃，保存。使用浓度为 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，若 PCR 产物条带单一，直接将产物送由北 京诺赛生物公司测序。

3.2.5 RACE 法扩增 esdC 基因的全长 cDNA

(1) 3' 和5' RACE ready cDNA 的合成。 3' 和 5' RACE ready cDNA 以谢瓦氏曲霉间型变种产子囊孢 子初期的总 RNA 为模板，按照 SMARTer RACE cD-NA Amplification Kit 说明书进行合成。

(2) 3' 和 5' RACE cDNA 的扩增。根据测序获得 的 esdC 基因扩增的片段序列设计一对基因特异性引 物(GSP)，分别用于 3' RACE 和 5' RACE 的扩增。引物 信息如下：

10×Universal Primer A Mix (UPM)uncultured mi- croorganism

Long (0.4 μmol/L)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCGAGT-3'

Short  (2  μmol/L)：5'-CTAATACGACTCACTAT AGG GC-3'

3' RACEGsp1：5'-GCATCCACCACCCAAAGCC CTCCA-3'

5' RACE Gsp2：5'-TCGACTCCGTCACGTATCC GCACC-3'

反应体系(25 μL)：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL， 10 ×UPM 2.5  μL，GSP  引 物 1 μL，3'/5'-RACE Ready cDNA 1.5 μL，补足 ddH2O 至 25 μL。反应程序：94℃ 30 s，72℃ 3 min，循环 5 次；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃3 min，循环 5 次；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，循环 30 次；12℃，保存。

(3)扩增产物的克隆测序。PCR 产物在 1.5%琼脂 糖凝胶电泳后，利用胶回收试剂盒回收产物，连接到 pMD R 19-T 载体，转化 E. coli DH5α 感受态细胞，筛 选重组子并进行菌落 PCR 验证，将阳性克隆送北京 诺赛公司测序。

(4)全长 cDNA 的序列拼接。根据测序结果利用 bioedit 软件进行拼接得到 esdC 基因的全长 cDNA 序列。

3.2.6 esdC 基因全长 cDNA 的获得及序列分析

(1)通过拼接得到 esdC 基因的全长 cDNA 序列，利 用 Softberry 的 Gene Finding 工具(http://linux1.softber-ry.com/berry.phtml)预测开放阅读框及翻译的氨基酸。在 NCBI (national center for biotechnology information, NCBI)上进行 BLASTn 和 BLASTx 同源比对。
 

(2) 基因序列预测的蛋白质氨基酸序列分析
蛋白质的基本分析：http://web.expasy.org/protparam/
疏水 / 亲水性分析：http://web.expasy.org/protscale /
跨膜结构分析：http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0
http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/cgi-bin/adv_sosui.cgi
重复序列分析：http://www.embl.de/~andrade/papers/rep/search.html
信号肽分析：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
保守结构域分析：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
亚细胞定位：http://wolfpsort.org/

作者贡献
刘荣是本研究的实验设计和实验研究的执行人；谭玉梅参与实验设计和论文修改；刘永翔参与试验结果分析和论文修改；刘作易是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。
 

致谢
本研究由贵州省农业科学院专项(黔农科院专项[2011]037)资助。作者感谢在实验过程中对本研究关心和帮助的贵州省农业生物技术重点实验室所有人。
 

参考文献

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Dyer P.S., and O'Gorman C.M., 2012, Sexual development and cryptic sexuality in fungi: Insights from Aspergillus species, FEMS Microbiol. Rev., 36(1): 165-192

Han K.H., Han K.Y., Yu J.H., Chae K.S., Jahng K.Y., and Han D.M., 2001, The nsdD gene encodes a putative GATA-type transcription factor necessary for sexual development of Aspergillus nidulans, Molecular Microbiology, 41(2): 299-309

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