鲨烯合酶(squalene synthase, SS, EC2.5.1.21)是植物甾醇和三萜生物合成过程中的一个关键酶，催化两分子法呢酯焦磷酸缩合生成鲨烯，在2,3-氧化鲨烯环化酶催化下，鲨烯转化为2,3-环氧化鲨烯(Beytia et al., 1973)。三萜皂苷是一类重要的植物次生代谢产物，有研究表明具有降低胆固醇、抗炎、抗凝血、保肝护肝等药理作用，同时具有抗菌和抗虫害的作用(许晓双等, 2014)。SS在鲨烯后续生物合成支路中处于关键地位，其含量和活性决定了后续产物的合成，如诱导银柴胡(Kim et al., 2011b)、刺五加(Seo et al., 2005)、睡茄(Patel et al., 2015)等鲨烯合酶的表达，能够提高其三萜皂苷和植物甾醇的含量；抑制人参鲨烯合酶的表达则可降低其三萜皂苷的生成量(Han et al., 2010; 何闪等, 2013)

黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科黄瓜属一年生草本蔓生攀缘植物，白皮黄瓜是它的一个品种。黄瓜果实中除含丰富的维生素 A、C、E和大量对人体有益的矿物质，还含有丙醇二酸，能抑制糖类转化为脂肪。葫芦素(cucurbitacins)为葫芦烷型四环三萜类化合物，近年来研究发现对急性肝损伤及酒精肝具有保护作用(昌友权, 2006)，同时具有抗炎(乔静等, 2012)、抗肿瘤(张延亭等, 2012)等多种生物活性作用。葫芦素C是黄瓜植株中的苦味成分，在鲜嫩叶子中的含量最高，但是随着叶变枯萎而下降，而葫芦素C单体化合物在室温或者甲醇溶液中均能稳定存在(卿志星等, 2014)。黄瓜转录组学研究表明，葫芦素C是由黄瓜的9种基因参与的4步催化反应生成而得。转录因子Bl和Bt分别调节叶子和果实通路，基因组信号追踪提示在培育过程中加强Bt的选择可从苦味黄瓜亲代中产生无苦味黄瓜(Shang et al., 2014)。葫芦素C在自然界中很少被发现，目前仅发现存在于葫芦科黄瓜属植物黄瓜。葫芦素C与葫芦素B具有相似的结构，葫芦素B已经被开发成为抗肝癌药物——葫芦素片。因此，葫芦素C具有潜在的药用价值。鲨烯合酶作为催化萜烯类物质生物合成的第1个关键酶，因而，其研究倍受重视，目前很多物种的SS基因被克隆及功能分析，如甘草(荣齐仙等, 2011)、北柴胡(隋春等, 2010)、刺五加(龙月红等, 2012)、茯苓(Wang et al., 2014)、金铁锁(戴住波等, 2008)，而GenBank登载的陆生植物SS基因已有50多种，但对白皮黄瓜SS基因的相关研究尚未见有报道。

作为三萜合成通路关键酶，鲨烯合酶SS基因的克隆使植物内萜类物质代谢调控机制和植物抗病机理研究深入到分子水平，为在分子水平上探讨三萜皂苷生物合成机理及其在药用植物中的应用具有重要意义。本研究采用RACE技术克隆白皮黄瓜SS基因的cDNA序列，并进行生物信息学分析，为揭示鲨烯合酶在白皮黄瓜三萜生物合成中的作用及生物工程中的应用奠定基础。

1结果与分析

1.1白皮黄瓜总RNA提取

1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，28S与18S的亮度比约为2:1，说明所提的白皮黄瓜总RNA较完整。经蛋白核酸分析仪检测，A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.91，说明所提取的RNA纯度高，可用于下一步实验(图1)。

1.2白皮黄瓜SS基因3'RACE及5'RACE扩增

通过3'RACE扩增得到片段长度为1 200 bp左右的特异条带，5'RACE扩增得到片段长度为500 bp左右的特异条带(图2)。

1.3白皮黄瓜SS基因核苷酸序列分析

利用Vector NTI Suite 6.0软件拼接及人工校对后，得到两条CsSS基因cDNA序列，其长度分别为1 627 bp和1 534 bp，两者ORF完全相同, 差异位于编码区外的3’UTR (CsSS1比CsSS2多82个碱基) (图3)。翻译起始点位于第3个碱基处，终止密码子为TGA，位于第1 253个碱基处，包含了一个1 251 bp的完整开放阅读框ORF，编码417个氨基酸残基。使用NCBI Blast比对，与葫芦科植物绞股蓝、罗汉果等植物的核苷酸序列同源性分别达到87%和92%；氨基酸序列的同源性则为88%和95%。

1.4白皮黄瓜SS基因氨基酸序列分析及蛋白质结构预测

利用Mega4.0软件分析表明，白皮黄瓜SS基因编码417个氨基酸残基，经NCBI Blast比对，白皮黄瓜氨基酸序列与葫芦科植物绞股蓝、罗汉果的同源性分别达到88%和95%。通过Protparam软件分析，得到白皮黄瓜氨基酸序列相对分子质量为47.6 kD，等电点为7.90，带正电残基(Arg+Lys)为51, 负电残基(Asp+Glu)为49。其不稳定系数为40.87, 脂肪系数为97.99,总平均亲水性(GRAVY)为-0.034。由此可知，初步预测白皮黄瓜SS蛋白为亲水性蛋白。

利用Protscale对该蛋白质亲水性与疏水性进一步预测，结果显示，最小值为-2.300, 最大值为3.422，数值大于0表示疏水性，小于0表示亲水性。介于0.5~-0.5之间的主要为两性氨基酸，其中Ile分值为4.5，疏水性最强，而Arg分值为-4.5，亲水性最强(图4)。

在线网站http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html预测白皮黄瓜SS跨膜区域。结果表明，此蛋白包含3个跨膜区，其在氨基酸序列上分别位于169~187、285~301和389~408位之间，与葫芦科植物红花栝楼预测的结果一致性较高(图5)。

对白皮黄瓜SS基因的蛋白二级结构进行预测，结果显示其二级结构中含α螺旋(alpha helix) 65.71%，β转角(beta turn) 6.71%，扩展链(extended strand) 10.07%，无规卷曲(random coil) 17.51%。由SWISS-MODEL Workspace在线分析软件建立CsSS三维结构模型(图6)。利用在线软件Signal P 4.0 Server分析表明，白皮黄瓜鲨烯合酶SS蛋白结构中无信号肽，是一种非分泌蛋白，其亚细胞定位于质膜上。

1.5 SS基因序列比较及进化树分析

利用Vector NTI Suite 6.0将得到的白皮黄瓜SS与GenBank登载的植物SS的氨基酸序列进行多重比对(表1)，以藻类植物等的SS作为外类群构建系统发育进化树(图7)。结果显示，白皮黄瓜与葫芦科植物罗汉果、红花栝楼、绞股蓝的亲缘关系最近。经NCBI Blast比对，白皮黄瓜SS基因的氨基酸序列与已知植物SS的同源性为80%~95%，核苷酸序列同源性为78%~92%。保守区域预测结果表明，白皮黄瓜SS保守序列位于N端和中间。

2讨论

本研究从白皮黄瓜中克隆得到萜类合成途径中的关键酶鲨烯合酶基因CsSS两个cDNA克隆，并对其cDNA序列进行了生物信息学分析。目前GenBank登载葫芦科植物的SS基因序列只有罗汉果和绞股蓝及预测得到的黄瓜、香瓜等。而本研究克隆得到的白皮黄瓜及前期得到的红花栝楼(陶晨陈等, 2015) SS基因序列，有助于在分子水平上对葫芦科三萜皂苷生物合成途径关键酶基因功能研究的深入，有利于进一步了解葫芦科植物的生物特性，并为SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础。

本研究利用3’RACE技术和简并引物扩增技术，首次从白皮黄瓜中克隆获得长度为1 627 bp和1 534 bp的两条cDNA序列，都编码417个氨基酸。由于5’端采用简并引物扩增的方法，根据葫芦科罗汉果的序列预测白皮黄瓜SS基因的5’末端大约有350 bp尚未扩增出来，但所得到的cDNA序列包含了白皮黄瓜SS基因完整的读码框和主要的功能区域；并且得到的两条序列中，其编码序列相同，并没有影响其编码鲨烯合酶蛋白。今后将进一步研究得到白皮黄瓜5’末端序列，并进行原核表达分析其功能区域是否与预测一致。

随着人们对鲨烯合酶基因研究的深入，越来越多植物鲨烯合酶发现有两个或两个以上的拷贝数，例如人参(Kim et al., 2011a)、拟南芥(Busquets et al., 2008)、丹参(马艺沔等, 2014)等，这些植物中三萜量较为丰富，具有多个不同表达模式的鲨烯合酶基因。本研究得到的白皮黄瓜2个鲨烯合酶克隆，进一步证明了一个基因具有多个拷贝的事实。根据基因序列结构比较分析，这2个基因编码的蛋白相同，很可能是通过基因平行复制而来的平行同源基因。由于鲨烯合酶是以FPP作为底物来合成三萜，诱导SS的表达能增加植物甾醇及三萜类化合物的生成量，而抑制SS的表达则促进倍半萜、类胡萝卜素等的生物合成，因而通过调节鲨烯合酶的含量和活性可以提高相关物质的产量(蒋东等, 2014; 张萍等, 2014)。如人参的3个鲨烯合酶基因都能够编码有活性的鲨烯合酶(Kim et al., 2011a)，而拟南芥2个鲨烯合酶基因中，只有一个基因能够编码有活性的鲨烯合酶(Busquets et al., 2008)，因此有利于人参特异的三萜皂苷的生成。本研究中克隆的2个白皮黄瓜鲨烯合酶基因也可能在黄瓜甾醇和三萜生物合成中具有不同调节作用，而这两个平行同源基因之间是如何相互配合调节？是否和人参SS一样也具有多种不同表达模式？在黄瓜的基因组中，这两个SS的分布有什么特征？还有待于进一步研究。

3材料与方法

3.1植物材料

白皮黄瓜种子购于柳州市兴旺蔬菜良种经营部，于2015年3月中旬种植于广西医科大学校园内，6月份采集生长旺盛植株的新鲜叶子，清洗干净，立即放入液氮，做好记录，转存于-80℃超低温冰箱贮存，作为样本材料。

3.2试剂

Total RNA提取试剂盒、3'-Full RACE Core Set with Prime Script^TM RTase、柱式胶回收试剂盒、LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶等购买于TaKaRa公司；pEASY-T1 Cloning Kit、Transl-T1感受态细胞为全式金公司产品；质粒提取试剂盒为天根公司产品，其他试剂均为国产分析纯产品。

3.3白皮黄瓜总RNA提取

按照TaKaRa公司的Total RNA提取试剂盒方法提取白皮黄瓜总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用DNA/Protein Analyzer检测总RNA的质量和浓度。

3.4白皮黄瓜cDNA第一链的合成与3'RACE扩增

根据GenBank登载的绞股蓝、罗汉果等SS基因cDNA序列以及本课题组前期克隆的红花栝楼SS cDNA序列，设计引物hgss01和hgss02 (表1)扩增3'端序列，引物由上海生工合成。以白皮黄瓜总RNA为模板，按试剂盒3'-Full RACE Core Set with Prime Script^TM RTase说明书操作反转录合成cDNA第一链。

以白皮黄瓜反转录产物得到的cDNA第一链为模板，分别以Hgss01、Hgss02与试剂盒中的3'RACE Outer Primer、3'RACE Inner Primer为引物，采用巢式PCR的方法扩增。第1轮PCR反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s、55℃~52℃退火30 s、72℃延伸90 s，退火温度每降1℃运行5个循环，总共20个循环，最后72℃延伸10 min。以第1轮PCR产物为模板进行第2轮巢式PCR。第2轮PCR反应条件为94℃预变性3 min，然后以94℃变性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸90 s 运行30个循环，最后72℃延伸10 min (陶晨陈等, 2015)。

琼脂糖凝胶电泳检测并对目的片段进行胶回收，连接到pEASY-T1载体，转化到Transl-T1感受态细胞中，挑取单一阳性克隆扩大培养，菌落PCR鉴定及提取质粒并进行双酶切鉴定，将阳性克隆送到上海生工测序。

3.5 5'RACE扩增

根据白皮黄瓜3'端克隆测序的结果，设计下游特异引物Hgss03和Hgss04。上游引物则是根据Genbank已有的鲨烯合酶序列，设计简并引物ssjbf2和ssjbf5 (表1)。PCR扩增方法与3'RACE相同。以cDNA第一链为模板，进行巢式PCR，扩增产物回收后连接到pEASY-T1载体，转化到Transl-T1感受态细胞中，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定并提取质粒双酶切鉴定，将阳性克隆送到上海生工测序。

3.6信息学分析

将3'RACE和5'RACE扩增得到的序列用Vector NTI 6.0软件进行人工拼接得到白皮黄瓜SS基因全长cDNA序列。利用Mega4.0软件分析白皮黄瓜SS基因cDNA全长序列性质，利用在线软件对其二级结构、三维结构进行预测分析。用Vector NTI Suite 6.0软件对白皮黄瓜与Genbank登载的植物SS氨基酸序列进行相似性比对，构建SS基因系统进化树。

作者贡献

马成通是本研究的实验设计和实验研究的执行人，参与论文撰写；钱洁颖完成实验数据收集及处理，刘镛指导生物信息学数据的分析；陶晨陈负责实验指导、序列审核；苏荷玲参与实验数据辅助分析，晁耐霞参与实验的设计及实验结果分析；吴耀生是项目负责人，指导实验设计和数据分析及论文写作与修改。

致谢

本研究由国家自然科学基金(No.31260069)和广西高等学校科研项目(No.201203YB038)共同资助。

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