醛作为一种高活性的化合物，能够诱导包括DNA和蛋白质形成在内的多种细胞毒性。醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)超家族是一类依赖NAD(P)⁺ 的多功能蛋白。人ALDH超家族成员至少存在19种，根据进化距离和氨基酸相似性对其命名。ALDH家族成员可通过氧化反应催化内源性和外源性醛，使之不可逆的转变为相应的酸，保护机体免受醛类物质的毒害(Fontaine, 2002)。虽然许多ALDH酶具有广泛的底物活性且能氧化多种脂肪族和芳香醛，但是仍有一些ALDH具有唯一的底物偏好性。例如ALDH2的水解活性与硝酸甘油的联系密切且能被乙酰氨基酚的结合蛋白所识别；ALDH1能够结合雄激素、胆固醇和甲状腺激素；醛脱氢酶在维持细胞内环境稳定中起着至关重要的作用。ALDH能够通过生成NADH再生还原型谷胱甘肽(GSH)以促进细胞的抗氧化能力。此外， ALDH3可以通过还原半胱氨酸和甲硫氨酸巯基清除羟自由基(Mann, 1999)。

目前发现的ALDH蛋白均具有较为保守的NAD(P)⁺结合区域和催化区域。但由于其构象的不同赋予了家族成员不同的职能(Izaguirre, 2002)。ALDH1和ALDH2研究相对较多，但ALDH3和ALDH4的研究并不深入，这在极大程度上是由于这两个家族的蛋白在体外的稳定性不理想所致。本研究通过生物信息学方法对已克隆出的多组ALDH超家族成员进行比对研究，系统比较ALDH家族的各项理化系数与结构差异，基于蛋白质工程原理对不稳定蛋白进行模拟突变和预测分析，为进一步深入研究ALDH奠定基础。

1结果与分析

1.1氨基酸序列的聚类对比分析

将来源于人、牛等不同物种的多个ALDH亚群的氨基酸序列在CLUSTALX和MEGA5.0软件中进行分子进化树分析，基于Neighbor-Joining的原理建树(图1)，结果显示ALDH1~ALDH7家族分别归属于7个不同的分支，且每个分支聚类明确(Lan, 2013)。由此可见，该蛋白的聚类分析不是由物种进行分类，而是由ALDH的各个亚家族的差异进行聚类，进而说明虽然物种间差异巨大，但ALDH亚家族内部的氨基酸序列相似性极高且足以稀释物种间的差异。各分支内部的不同物种聚类进化距离分析发现，人类的ALDH基因均处于进化树远端，可见人类ALDH的进化发生较晚，功能也较为复杂。

1.2 ALDH蛋白特性对比分析

利用SignalP 3.0 Server和TMpred网络服务器对ALDH进行跨膜区分析，应用Wolf-psort软件进行蛋白的亚细胞定位分析(Chang, 2014)。结果发现在ALDH1氨基酸序列中具有跨膜区(183~203, 223~244, 457~480)定位不明确；ALDH2中具有跨膜区(178~208, 228~248, 462~485)定位于线粒体；ALDH3中具有跨膜区(118~137, 391~410)定位于线粒体、胞质和细胞核；ALDH4中具有跨膜区(210~232)定位于线粒体；ALDH5中具有跨膜区(188~210, 211~230)定位于线粒体；ALDH6中具有跨膜区(25~44, 188~208, 306~327)定位于线粒体；ALDH7中具有跨膜区(157~175, 191~210, 283~305)定位不明确。在上诉7个家族的定位中，除ALDH1和ALDH7定位不明确外，均定位于线粒体中。各ALDH家族蛋白均在170~220的氨基酸间形成跨膜区域。这与一些文献报道的亚细胞定位实验结果一致。

在ExPASy Proteomics Server网站上用ProtParam软件对ALDH蛋白进行预测，统计Instability index、Ext. coefficient、Aliphatic index值、GRAVY值、pI值等一系列数据，分析后发现GRAVY值(-0.284~0.01)和分子量(47 974.0~61 810.5)在不同物种、不同ALDH亚群间没有典型的规律性分布；但不同物种间的同一ALDH亚群的pI值较为稳定，不会因为分子量的大小和氨基酸的分布而改变。各ALDH家族的蛋白质不稳定指数同样差异显著，ALDH3和ALDH4的不稳定指数>40，表明这两种家族的成员在体外稳定性很差。脂肪指数结果显示：ALDH3和ALDH7家族脂肪指数(91.29±1.78)远高于其他家族(84.37±2.38)。GRAVY值均为负值，表明ALDH蛋白均为亲水性蛋白，均有助于与NAD(P)⁺和醛类的醛基结合(图2)。

1.3氨基酸序列比对与高级结构比对

利用Vector NTI、NCBI BLAST软件对ALDH蛋白进行比对分析，进行ALDH全家族氨基酸的同源性为44.4%，相似性为2.4%。ALDH亚家族成员内的比对分析，发现ALDH1同源性为99.4%，相似性为62.5%；ALDH2同源性为99.8%，相似性为86%；ALDH3同源性为96.6%，相似性为40.7%；ALDH4同源性为99.3%，相似性为70.5%；ALDH5同源性为95.1%，相似性为63.7%；ALDH6同源性为98.0%，相似性为72.5%；ALDH7同源性为94.6%，相似性为54.9%。上述比对结果提示，ALDH家族间的序列相似性较高但同源性相对较低，氨基酸序列差异较大。ALDH超家族的同源性在45%左右，相似性却只有2.4%左右，说明ALDH的各个亚家族虽同属于醛脱氢酶，但其亚群间的氨基酸序列具有较大差异。

在PBIL网站上使用SOPMA软件对ALDH进行二级结构预测表明：ALDH1包含42.77%的α-螺旋、17.97%延伸带、11.13%β转角和28.12%随意卷曲构成；ALDH2包含43.52%的α-螺旋、18.38%延伸带、9.67%β转角和28.43%随意卷曲构成；ALDH3包含46.15%的α-螺旋、17.31%延伸带、10.04%β转角和26.5%随意卷曲构成；ALDH4包含37.3%的α-螺旋、20.96%延伸带、8.17%β转角和33.57%随意卷曲构成；ALDH5包含43.18%的α-螺旋、15.33 %延伸带、9.35%β转角和32.15%随意卷曲构成；ALDH6包含37.76%的α-螺旋、19.81%延伸带、10.09%β转角和32.34%随意卷曲构成；ALDH7包含39.33%的α-螺旋、22.31%延伸带、8.61%β转角和29.75%随意卷曲构成(图3)。

基于日益庞大的蛋白质结构数据库，对蛋白质的高级结构进行预测和分析，有助于深入剖析其结构及功能。该研究用同源建模法，对蛋白质分子的三维结构进行初步模拟。应用SWISS-MODLE和WebLab ViewerLite软件构建ALDH1~4四级结构和三级结构进行功能位点与结构的比较分析，结合Swiss-PdbViewer拉式构象图进行蛋白构想合理性评估(Biasini, 2014)。分析Psi和Phi角分布，超过90%的氨基酸残基位于理想Psi和Phi角分布区域内，可见预测结构的排布稳定，同源建模结果可靠(Johansson, 2012)。

ALDH1 (除ALDH1A3)和ALDH2为同源四聚体，ALDH3和ALDH4为同源二聚体，但各ALDH亚家族单体均具有典型的催化区域、NAD(P)⁺结合域、齐聚反应域和保守的功能位点(图4)。ALDH1被视为催化视黄醛转化为视黄酸的重要蛋白，具有活性位点Glu267和Cys301。ALDH2具有硝酸甘油的结合域和乙醛结合域和活性位点Glu284和Cys318，主要担负催化硝酸甘油和乙醛的职责。ALDH3具有保护视力不受紫外线伤害的作用，含NAD(P)⁺结合域和活性位点Asn115和Tyr116。ALDH4含有醛结合环和活性位点Glu447和Phe449。蛋白高级结构比对可知每个亚家族都有相对保守的功能域和保守位点，这是进行配体结合与催化选择的关键，有助于通过查询ALDH家族成员保守位点预测蛋白调节功能。

1.4不稳定蛋白的修饰与预测

蛋白质的稳定性直接影响生物分子的功能和活性，它是评价蛋白的一个基本特征。蛋白质的稳定性不仅取决于外部环境更取决于蛋白质的内在属性。因此对于结构不稳定的蛋白质可以进行蛋白质工程方法修饰蛋白，从而达到增强稳定性的目的。ALDH3和ALDH4的不稳定指数>40，稳定性较差。基于疏水相互作用和二硫键的应用，设计两个ALDH3突变位点Y³⁶⁵C和E³²⁸C，ALDH4突变位点K³⁴⁷M和T²¹³M (Elsohly, 2015)。应用I-mutant2.0软件计算DDG值(Kcal/mol)如表1，该预测方法基于SEEF的方法模拟程度较高，DDG值>0表示稳定性增减，DDG<0表示稳定性降低(Emidio, 2005)。结果显示：再pH为7.0时，ALDH3蛋白Y³⁶⁵C和E³²⁸C突变随温度增高稳定性增加，ALDH4蛋白的K³⁴⁷M和T²¹³M突变最稳定环境出现在40℃。该修饰预测结果有助于进一步研究该蛋白的特性。

2讨论

醛脱氢酶超家族蛋白存在于多个亚细胞区域，包括线粒体、细胞质、内质网和细胞核。超家族各成员单体均具有典型的催化区域、NAD(P)⁺结合域、齐聚反应域和保守的功能位点，其中均含有一个催化口袋，由于该口袋的结构限制的配体差异赋予了各成员具有不同的催化活性。

ALDH同工酶无论在动物、植物还是微生物中都起着至关重要的作用。ALDH与人类多种疾病呈正相关，如ALDH1与结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌的发生相关。ALDH2与酒精性肝病、消化道肿瘤、白血病、先天性心脏病等密切相关。该家族许多蛋白质已经被定义，但缺乏相应的系统化归类研究(Olen, 2012)。ALDH1被认为是参与视黄醛转化为视黄酸代谢的重要蛋白(Erika, 2010)。ALDH2线粒体同工酶在乙醇代谢中将乙醛转化为乙酸并参与硝酸甘油的代谢(Lang, 2012)。在眼角膜中，紫外诱导脂质过氧化产生醛，ALDH3能够催化该醛起到解毒作用(Perozich, 2000)。ALDH4与脯氨酸的降解有关，能够将脂肪和芳香族醛催化为酸进行脱毒(Pemberton, 2014)。ALDH5为四聚体催化γ-氨基丁酸分解代谢的最后一步催化琥珀半醛转化为琥珀酸盐。ALDH6是唯一已知的依赖于辅酶A的人ALDH。ALDH7可催化α-氨基己二半醛氧化成α-氨酸，在哌啶酸通路中发挥主要作用(Luo, 2015)。本研究通过对ALDH超家族进行生物信息学比较分析。发现虽同属ALDH家族且蛋白结构相似，但由于催化结构、作用位点、亚细胞定位和组织定位的差异赋予了各家族成员不同的催化活性。同时通过信息学方法对不稳定的ALDH3和ALDH4蛋白进行蛋白修饰和预测，为深入开展ALDH相关研究奠定基础。

3材料与方法

3.1数据来源

以ALDH1~ALDH4家族为出发点，在NCBI及PBD数据库中运行BLAST程序，找出ALDH家族核酸序列及蛋白序列各121个作为候选，应用Vector NTI软件剔除序列过长或过短的干扰蛋白。最终确定涵盖ALDH1~ALDH4及典型ALDH亚家族的核酸及蛋白序列82个。

3.2 ALDH亚家族的核酸及蛋白序列的生物信息学分析

应用Vector NTI对ALDH家族的核酸序列进行对比分析，应用Expasy数据库中ProtParam软件(http://www.expasy.org/tools/ProtParam.htlm)对比分析并统计目的蛋白的理化特性包括：等电点，分子量，氨基酸数目，脂肪系数，亲疏水系数等。在ExPASy Proteomics Server网站上用ProtScale软件(http://web.expasy.org/protscale)对ALDH蛋白的氨基酸序列进行亲/疏水性预测。Vector NTI8.0软件对其进行保守序列分析比对。应用WoLF PSORT在线软件(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)对ALDH蛋白进行亚细胞定位预测。TMHMM Server v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Tmpred软件对蛋白的跨膜区域进行预测。在PBIL网站上使用MLRC软件对ALDH进行二级结构预测。蛋白结构域建模比对分析和分析结果评估通过Clustal X、MEGA5.0、Swiss Modle、Swiss-PdbView和WebLab ViewLite完成(常凯, 2015)。在I-Mutant网址进行SEEF方法的稳定性模拟。

作者贡献

常凯完成论文构思、数据分析统计和写作；童立冬、江忠勇、张睿、熊怡淞参与材料收集与整理；熊杰完成论文修改。

致谢

本研究由四川省科技厅应用基础研究项目(2013JY0173)基金资助。

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