大量研究表明，不育和可育胞质的线粒体是有差别的，随着人们对植物生殖发育的分子生物学和植物雄性不育机理的深入研究使人们确信细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)与线粒体基因组的突变和重组有着密切的关系，且线粒体酶活性的异常与雄性不育现象有着密切关系(巴青松等, 2015)。而线粒体ATP合酶是生物体内进行光合磷酸化和氧化磷酸化反应时合成ATP的关键酶，是mtDNA编码的一个重要蛋白，是能量储存、运输和供应的主要载体，它在植物体生长发育过程中起着重大作用。花的形成是植物生殖生长阶段最为显著的特征(韩瑶瑶等, 2015)。花粉细胞是植物雄性器官中的重要细胞，在植物授精、遗传物质的传递等生殖过程中具有重要作用(张姣等, 2015)。在花粉发育过程中，若未得到充足的能量供应，势必会影响花粉的正常活动从而影响其育性。研究表明，ATP合酶与植物雄性不育性之间存在很大关系，姚雅琴等(2002)研究认为K型小麦细胞质雄性不育系与保持系之间存在的ATP酶活性差异可能是导致小麦花粉败育的重要因素。侯建华(2003)等采用比较生理学的方法对甜菜细胞质雄性不育系及其保持系生殖生长阶段的ATP酶活性进行了研究，结果表明不育系低于其保持系。另外有很多报道也都认为雄性不育的产生是由于花药中的能量供求平衡受到破坏而导致的(伊风艳等, 2014; Sabar et al., 2000; 吕俊恒和邓明华, 2014)。

位于植物线粒体内膜上的ATP合成酶对花粉物质代谢、能量转化及其生长发育等生命活动起着重要作用(周伯等, 2015)。研究表明，编码ATP合酶的单个基因或者多个基因产物可能会因影响线粒体ATP合酶的功能，从而干扰高耗能的花粉发育过程而导致植物雄性不育的发生(Dieterichet al.,2003; Bergman et al.,2000)。ATP合酶由F₀和F₁两部分组成，F₀部分包括atp6、atp9、orf25和orfB 4个亚基基因，大量研究表明，在许多植物中这4个基因都与雄性不育性之间存在明显的关系(Nakajima et al.,2001; Sabar et al.,2003; Heazlewood et al., 2003; Kim and Kim, 2006; 段继强等, 2008;韩艳芬等, 2010; 张智等, 2012)。Nakajima等(2001)研究表明，胡萝卜线粒体内的orfB基因的结构与花瓣的表现型以及花的CMS性之间存在一定的相关性，并且它的表达是由转录后水平来调节的。Das等(2010)就籼稻不育系及其同型保持系的atp6和orfB这两个线粒体基因进行了RELP检测，结果表明两系的atp6基因在RNA结构上无差异，但是在不育株系中的orfB基因具有一个更长的转录本；5’RACE分析表明，长的orfB转录本比保持系的多370bp，将其与基因组DNA序列比较显示长的转录本并非嵌合基因，这表明orfB基因很可能与水稻的雄性不育性有关。对芥菜线粒体基因的研究表明，orfB基因很可能与芥菜CMS性有关(Yang et al., 2009)。烟草由于易于进行分子生物学等方面的操作，已成为植物分子领域常用的模式植物(余世洲等, 2015; 吕玉伟等, 2016)，我们此前报道过其ATP合酶F₀部分的atp6(赵婷等, 2009; 周玮等, 2012)、atp9(周玮等, 2007)、orf25(刘齐元等, 2009)基因与雄性不育性有关联，但目前还未曾见过有关orfB基因与烟草CMS之间关系的报道。

本研究对3对烟草雄性不育系及其相应保持系中的orfB基因进行PCR扩增和测序分析，研究不育系及其保持系之间线粒体ATP合酶F₀部分的orfB基因在DNA序列上的差异。该研究旨在探究orfB基因与烟草雄性不育之间的关系，以期进一步探讨ATP合酶F₀部分4个亚基联合作用与烟草雄性不育性的关系，为进一步研究烟草CMS分子机理提供基础。

1结果与分析

1.1烟草花蕾总DNA质量的检测

取3 μl总DNA提取液电泳检测其完整性。结果表明，所提取的总DNA质量较好，条带完整，无降解。采用紫外分光光度法测定结果表明，所有样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀均为1.8~1.95，表明其中无蛋白质污染且浓度均达到100 ng/μL左右(图1)。综上可知所提取基因组DNA质量能够满足进一步试验的要求。

1.2orfB基因的特异引物PCR扩增

目的基因orfB的特异引物PCR扩增产物经电泳检测(图2)表明，扩增产物在3种供试材料间不存在差异，且在大概600bp处均有一条明亮清晰的扩增条带，与预期片段大小(604bp)相吻合，说明该引物的扩增产物即为orfB基因的DNA片段。

1.3 orfB基因的测序结果与序列分析

测序结果表明，18个样品中，特异片段的核苷酸序列长度均为604bp。目的基因orfB自身DNA序列长度为471bp，且每个测序样品中均包含了该基因的全部序列。

BLASTn分析表明(图3)，9个保持系材料的orfB基因序列没有差异，且与GenBank中所收录的该基因序列完全一致，相似性均为100%。这进一步说明了PCR产物即为本实验研究的目的基因，也说明了各供试材料测序结果的准确性。9个不育系材料的orfB基因序列也完全相同，但与GenBank中所收录的该基因序列略有差别，相似性均为99.79%。这一结果说明从不育系材料中所扩增出来的产物是目的基因orfB，但其在不育系与保持系之间存在碱基差异位点。

序列比对后发现，保持系与GenBank中的orfB基因序列相同；不育系较保持系和GenBank中的orfB基因序列，在第363位点存在1个由A→C的碱基突变，且在9个不育系材料中的碱基突变位点完全相同(图3)。

在中烟90与MS中烟90的部分测序峰里，9个不育系材料中，orfB基因的测序峰图都存在同样位点的碱基突变(图4)。另外，将不育系与保持系orfB基因序列翻译成相对应的氨基酸序列，结果发现不育系中第363位点的碱基改变导致了该位点所编码氨基酸的变化，即由保持系中的亮氨酸(Leu)变成了不育系中的苯丙氨酸(Phe)。推测这种结构的变化是引起烟草雄性不育的重要原因之一。

2讨论

atp9、atp6、orf25和orfB是组成线粒体ATP合酶F₀部分的4个亚基，而F₀部分是ATP合酶酶蛋白的膜内区域，具有质子跨膜传输功能，在线粒体合成ATP时起到很重要的作用。据报道，F₀部分的4个亚基基因均与植物细胞质雄性不育的形成存在某种联系(Heazlewood et al., 2003)。另外，段继强等(2008)研究认为苎麻CMS与不育系线粒体中atp9基因在编码区3'端的碱基异常和缺失这种异常结构有关。Mouras等(1999)对烟草引入未编辑的atp9基因后，导致烟草雄性不育的产生；再使用反义RNA技术抑制转基因烟草中未编辑的atp9基因表达后，能够恢复转基因烟草的育性。这进一步证实了线粒体基因组中的atp9基因和烟草雄性不育性之间的关系。张智等(2012)也认为atp9基因结构上的变异及其异常表达与胡萝卜CMS有着密切关系。Mohr等(1993)认为线粒体中orf25和atp6基因序列上游发生的基因重组可能导致了T型提莫菲维小麦CMS的形成。Kim等(2006)研究认为atp6基因是辣椒CMS形成的一个候选基因。施真等(2012)的研究也发现atp6基因转录本的RNA编辑导致的氨基酸变化与甜菜CMS有一定关系。韩艳芬等(2010)采用克隆测序与PCR产物直接测序法发现黏类小麦CMS性与线粒体atp6基因转录本保守区的编辑有一定的相关性。Sabar等(2003)认为包含了部分orfB基因的嵌合开放阅读框的表达与向日葵CMS的形成有关。这些研究均表明，ATP合酶中F₀部分的4个亚基基因序列上的变化确实与植物雄性不育存在某种联系。

本研究通过对3对烟草胞质雄性不育系及其同型保持系线粒体ATP合酶F₀部分的orfB基因序列进行扩增和测序后证明了与同型保持系相比，所测序的9个不育系样品中的orfB基因序列都存在363位点的碱基突变，且均导致了所编码氨基酸种类的变化。在实验过程中对每个样品重复进行了3次测序，且每个目的基因的测序结果在所有测序的不育系材料中都保持一致。另外在后续实验(另文发表)中用相同的材料对该基因的cDNA进行测序，cDNA中也存在与DNA一致的碱基突变位点，这进一步证实了实验结果的准确性。

从实验结果及之前的相关报道来看，可以证实烟草细胞质雄性不育系中线粒体ATP合酶F₀部分的4个亚基基因atp9、atp6、orf25、orfB确实存在不同位点的碱基突变，且大多数位点的突变都导致了该位点所编码的氨基酸变化。烟草雄性不育系中这4个基因中的一个或者几个或者全部的基因突变位点很有可能就是导致烟草细胞质雄性不育产生的重要突变位点，但是至于这些基因发生的碱基突变是如何影响ATP合酶的结构和功能，进而使机体的能量代谢受到影响，最终导致烟草细胞质雄性不育性的形成，还有待于更进一步的深入研究。下一步将对ATP合酶F₀部分的4个亚基基因的转录本进行测序，研究其编辑效应，分析转录水平上多基因与烟草雄性不育性之间的关系；进而利用生物信息学方法比较4个亚基基因推导蛋白在不育系和保持系中各结构层次(一级、二级、超二级和三级结构)上的差异，构建蛋白质互作模型，预测F₀亚基互作特征，构建F₀亚基互作网络，分析蛋白质水平上4个亚基基因的联合效应与烟草雄性不育性之间的调控机理。

3材料与方法

3.1实验材料

供试材料为3对新质源烟草细胞质雄性不育系及其同型保持系，分别为：(1)MS中烟90(MSzy90)和中烟90(zy90)；(2)MS云烟85(MSyy85)和云烟85(yy85)；(3)MSK326和K326。试验在江西农业大学农学院作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，于2015年3月~2015年9月份进行。

3.2DNA提取

取适量上述供试材料的花蕾，采用CTAB改进法(朱腾义等, 2010)提取烟草花蕾总DNA，所提DNA经纯化后进行检测。取3 μL DNA，加入溴酚蓝，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA浓度、分子大小及片段完整性。

3.3引物合成与PCR扩增

根据NCBI中GenBank数据库收录的烟草线粒体完全基因组序列(登录号: BA000042)，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计1对扩增orfB基因的特异性引物：上游引物B1F为：5'-ACTACTCGTACAGGCTTGAC-3'，下游引物B2R为：5'-TATCACCTTACCTTCCGTCA-3' (扩增片段长度604bp)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

以3个烟草雄性不育系及其保持系花蕾基因组DNA为模板，用所设计的引物对orfB基因进行PCR扩增，PCR扩增体系(25μL)如下：12.5 μL2×Taq PCR Master Mix、1 μL(5 μmol/L)上、下游引物、1 μLDNA模版和9.5 μLddH₂O。扩增程序为：94℃预变性3min、94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸1min、进行36个循环后再72℃延伸7min。反应结束后4℃保存。

3.4orfB基因的电泳检测与序列分析

取3μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DNA凝胶回收试剂盒将3种不育材料及其保持系的特异片段回收并测序，每个样品重复3次，序列测定工作委托生工生物工程(上海)有限公司完成。

利用DNAMAN软件将从烟草雄性不育系及其同型保持系扩增的orfB基因与GenBank数据库所收录的烟草orf B基因序列进行比对，并分析其编码的氨基酸序列。

作者贡献

陶瑶和王瑜是本研究实验工作的具体执行人，完成数据分析和论文初稿的撰写；吴凌敏、谢丽娟和聂亚平负责文献查阅、实验辅助；周玮、钟思荣和王建革负责部分实验操作以及图表的绘制；刘齐元是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(31260350; 31301388)和江西省教育厅科技计划项目(GJJ13275)共同资助。

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