基因组印记是一种不遵循孟德尔定律的遗传学现象，是指等位基因通过DNA或组蛋白的表观遗传修饰而产生的亲本基因差异表达的现象(Reik and Walter, 2001)。父源等位基因沉默，而母源等位基因激活的基因称为父源印记基因；反之，母源沉默父源激活的基因称为母源印记基因(Reik et al., 2003)。目前，印记基因的研究主要集中在人和小鼠中，被鉴定的印记基因总数超过200个，而牛中印记基因的研究相对较少，已经确认的只有34个(http://igc.otago.ac.nz/Search.html)。印记基因在染色体上成簇分布且高度保守(Thorvaldsen and Bartolomei, 2007)。成簇存在的印记基因，功能上互相关联，与个体的正常生长发育有紧密关系(Edwards et al., 2007)。

Phlda2基因(pleckstrinhomology-like domain, family A, member 2)，又被称为Tssc3基因，在人和小鼠的胎盘组织中被鉴定为父源印记基因，位于Cd-kn1c/Kcnq1ot1 印记区域中。Cdkn1c/Kcnq1ot1印记区域位于人11号染色体，小鼠7号染色体(Qian et al., 1997)以及牛29号染色体上(Guillomot et al., 2010)。该印记区域主要包括1个母源印记的基因Kcnq1ot1及8个父源印记基因 Ascl2、Tssc4、Cd81、Kcnq1、Cdkn1c、Slc22a18、Phlda2和Osbpl5 (Ager et al., 2008)。在哺乳动物中Phlda2基因调控胎盘的分化和胚胎早期的生长发育(Guillomot et al., 2010)。在Phlda2基因敲除小鼠中，胎盘生长过度；而 Phlda2基因的过表达会导致胎盘发育迟缓(Salas et al., 2004)。在人的脑瘤等恶性肿瘤中，Phlda2基因通过下调表达，参与肿瘤的发生(Müller et al., 2000)。

在牛中，Phlda2基因的结构与功能还没有被系统研究，本研究首先利用RT-PCR方法对Phlda2基因在牛组织中的表达进行了分析，进而应用生物信息学方法对牛Phlda2基因的分子进化、启动子位点以及编码的蛋白结构进行了分析预测，以其为进一步研究牛Phlda2 基因的功能奠定基础。

1 结果与分析

1.1牛 Phlda2 基因组织表达分析

采用RT-PCR方法对Phlda2基因在牛组织中的表达进行分析，Phlda2和GAPDH 基因分别扩增得到350 bp和550 bp左右的片段，电泳检测结果见图1，测序验证为目的条带。表明Phlda2基因在牛的心、肝、 脾、肺、肾、大脑、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盘10个被检测组织中均表达。

1.2 Phlda2基因核酸进化分析

从NCBI核酸序列数据库查询各种动物Phlda2基因的mRNA序列，共获得8种动物Phlda2基因的完整的CDS (coding sequence)序列(表 1)。8种动物的Phlda2基因CDS序列在398~458 bp之间，其中原鸡的编码序列最短，为398 bp，而人的编码序列最长，为458 bp。

利用MEGA5软件对上述8种动物的Phlda2核酸序列构建系统进化树，并进行分子进化遗传分析，结果如图2所示。选取的8种动物Phlda2核酸序列被分为两大组，其中斑马鱼和非洲爪蟾蜍为一组，其余6种动物为一组。在第二组中，原鸡是单独的分支，剩下的人、小鼠、牛、猪和袋鼠为一分支。表明哺乳动物的进化距离比其它物种的距离近，其中牛与猪的进化距离最近。遗传距离矩阵见表 2，发现在被分析的8种动物中，牛与猪遗传距离相对最小，为0.148。

1.3牛Phlda2基因启动子预测和转录因子结合位点分析

对牛Phlda2基因起始密码子上游5 000 bp的序列进行3种不同的在线软件预测，分析启动子结构。 Promoter 2.0软件分析结果(表 3)显示，发现潜在的启动子最可能位于700 bp附近。Neural Network Promoter prediction软件预测结果(表 4)显示，584~634 bp之间最有可能是启动子区域。用Promoter Scan在线软件分析，且cut-off值设置为0.8预测Phlda2启动子，结果显示在启动子区正义链上的 487~737 bp，启动子分值为65.81，且启动子剪切值=53.000 000。综合3个软件的预测结果，Phlda2基因启动子可能位于487~737 bp区域内。 

进一步用 Promoter Scan在线软件对牛Phlda2基因起始密码子上游5 000 bp范围进行转录因子结合位点扫描分析，在正义链上检测到包括TFIID、Sp1、APRT-mouse-US、GCF、A P-2、NF-S、T-Ag、CTF/ NF-1、EARLY-SEQ1、JCV_repeated_sequenc、PEA1、 NFI、APRT-mouse_US 等共20种潜在的转录因子结合位点，其中AP-2和Sp1结合位点出现频率较大，分别为15个和 30个。

1.4 牛Phlda2蛋白物理性质分析及高级结构预测

通过ExPASy上的在线软件Protparam和ProtScale，对牛Phlda2基因所编码的142个氨基酸 序列进行基本理化性质分析，表明该蛋白的分子量质量为15.86 kD , 蛋白分子式为C695H1118N212O206S4；理论等电点(pI)为9.63。Phlda2蛋白由20种氨基酸组成，其中Arg和Ala含量最高，各占14.1%和12%，His含量最低(0.7%)，未发现特殊的硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸。牛Phlda2蛋白状态不稳定，其不稳定系数(instability index)为46.50 (>40)，该蛋白是一个亲水性蛋白，总的平均亲水性为-0.554。

利用在线软件GOR4对牛Phlda2蛋白进行二级结构分析，发现牛Phlda2蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，分别占40.85%和40.14%，其余19.01%为延伸结构。

利用SWISSMODEL软件预测牛Phlda2蛋白的三级结构(图 3)，该蛋白包括一个血小板同源结构域(pleckstrin homology, PH)结构域。PH 结构域主要由两组反向平行的β片层结构和一个长的α- 螺旋结构构成，延伸链散布于整个蛋白质中。

图 3 SWISS-MODEL Workspace在线软件分析蛋白质三级结构

2讨论

利用生物信息学方法对基因结构、编码蛋白的理化性质及功能进行预测，是目前生物学研究的新热点。Phlda2蛋白和血小板都具有共同的血小板同源(pleckstrin homology domain, PH)结构域(Lemmon et al., 2002)，属于同一家族。血小板同源结构域通过结合磷酸烯醇脂，调控细胞信号的转导(Itou and Takenawa, 2002)、细胞骨架的构成和细胞膜的运输(Lemmon et al., 2002)。在胚胎发育早期，Phlda2基因可能通过细胞信号转导，调节各滋养层按正常比例生长，进而维持了胎盘结构和功能的稳定。利用MEGA5软件分析Phlda2核酸序列，发现它在哺乳动物中结构保守，这可能与它调控胚胎生长发育的重要功能有关。

基因的启动子和转录因子结合位点的预测，可为了解该基因功能和调节机制提供了重要依据。通过3种在线软件的预测发现Phlda2基因的启动子位置可能位于起始密码子上游487~737 bp区域内。预测其转录因子结合位点有20种，其中 AP-2 和 Sp1 的结合位点出现频率较大。转录因子Sp1对肿瘤有促进作用(白雪和邓红, 2010)，并调控细胞凋亡(Safe and Abdelrah,  2005)、DNA甲基化(Wahori et al., 2008)、细胞生长分化(Samson and Wong, 2002)、以及与核酸代谢和氧化磷酸化相关的许多持家基因的表达(Zaidal et al., 1999)等生物过程。转录因子AP-2是一种具有高度保守序列的激活蛋白(Mitchell et al., 1987)，参与细胞分化(Schwartz et al., 2007)及肿瘤发生(Popa et al., 2004)。近来研究表明转录因子AP-2在哺乳动物的胚胎发育过程中起重要作用，在AP-2基因敲除的小鼠中，出现严重胸腹缺陷的症状(Hilgerever et al.,  2000)。在多种肿瘤细胞系中，AP-2基因低表达或不表达，而高水平的AP-2可抑制肿瘤细胞的生长(Wajapeyee and Somasundaram, 2003)。Phlda2基因富含AP-2和Sp1转录因子的结合位点进一步预示了Phlda2基因在胚胎早期和癌症发生中的重要作用。

3材料与方法

3.1试验材料

试验用荷斯坦奶牛取自当地屠宰场，动物屠宰后，采集其包括心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盘在内的主要组织，投入液氮中速冻保存， 备用于RNA的提取。

3.2 主要试剂

Taq DNA Mix购自北京Tiangen生物公司；RNA提取(TRIzol)试剂盒购自Invitrogen公司；无RNase的DNase-Ⅰ购自大连宝生物公司；RT-PCR试剂盒和快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

3.3 总RNA提取与cDNA的合成

参照RNA提取试剂盒说明书提取心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盘组织的总RNA，用无RNase的DNase-Ⅰ除去DNA的污染后，琼脂糖电泳及Gene Quant 100紫外分光光度计(GE, 美国)检测RNA质量和数量。利用反转录试剂盒合成cDNA第一条链，反应体系为20 μL，其中总RNA 1 μL。合成的cDNA于-20℃保存备用。

3.4牛Phlda2基因的组织表达

利用RT-PCR检测牛Phlda2基因在组织中的表达。用于RT-PCR的内参基因GAPDH和目的基因Phlda2的参考序列，引物序列，退火温度及扩增片段长度见表 5。25 μL反应体系：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL (10μmol/L)，Taq DNA Mix12.5 μL，ddH₂O 10.5 μL。PCR反应条件如下：94℃变性5 min；94℃变性 30 s，退火 30 s，72℃延伸 45 s，35 个循环；72℃延伸 10 min。目的片段利用快速琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒纯化回收后直接进行测序。

3.5 Phlda2基因的生物信息学分析

核酸分子进化分析利用MEGA5 (molecular evolutionary geneticsanalysis)软件，采用邻近相连算法NJ (neighbor joining model)和泊松校验(poisson correction)的方法，构建系统进化树和遗传距离矩阵，自展检验(bootstrap test)估计NJ法所构系统树的可靠性(重复 5 000 次)，其余参数取默认值。

Phlda2基因启动子位置是通过NeuralNetworkPromoterPrediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)，Promoter2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和PromoterScan(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)在线软件分析进行预测，利用Promoter Scan在线软件进行转录因子结合位点预测。

利用在线网站ExPASy的在线软件ProtParam和ProtScale分析Phlda2蛋白物理性质，采用在线网站GOR4(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)对蛋白二级结构进行预测和功能分析。

作者贡献

赵姝君是本研究的主要完成者，在整个研究中贯穿始终，完成材料的采集、数据的软件分析及论文初稿的撰写与修改；王敬姣参与数据采集；吴茜红和王梦楠协助数据处理；李冬杰提供理论指导；通讯作者李世杰为项目负责人，进行理论指导和论文修改及整个研究的一切费用支出。

致谢

本研究由国家自然科学基金(31372312)和河北省自然基金项目(C2011204001)资助，衷心感谢河北农业大学生命科学学院对本研究的支持，感谢实验室同学对我的帮助！

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