反向遗传学，特别针对特定基因的敲除或沉默是研究基因功能的重要手段。目前，T-DNA广泛用于与拟南芥(Arabidopsis  thaliana)，番茄(Solanum lycopersicum L.)等植物的突变体的创建和基因功能的研究。但复杂遗传转化过程、基因致死突变、多基因家族应用困难等缺点限制了T-DNA技术的大规模应用。因而一些基因沉默的方法，如RNAi，病毒诱导的基因沉默(virus-Induced gene silencing)在植物基因功能研究中的应用越来越广泛。

与传统的转基因基因功能分析方法相比，VIGS 具有以下优点：(1)高通量。VIGS 除可以对一条序列 进行功能鉴定外，还可将cDNA文库整合到病毒载体上而进行高通量基因筛选分析，适合现代大规范基因功能分析。(2)速率高。VIGS操作简便，实验成本低，沉默后能够快速观察功能丧失表型。(3) VIGS可以迅速比较物种间同源基因功能(Scofield et al., 2005)。(4) VIGS可用于同一种植物不同遗传背景下的基因功能研究(Burch-Smith et al., 2004)。

2 VIGS载体来源

目前已经发现多种植物病毒可以用作VIGS基础载体，用于开发VIGS载体。如烟草花叶病毒(mosaic virus, TMV) (Kumagai et al., 1995)，马铃薯X病毒(potato virus X, PVX) (Angell and Baulcombe, 1997)， 番茄金花叶病毒(tomato golden mosaic virus, TGMV) (Kumagai et al., 1995)。但这些病毒载体都造成明显的侵染症状，如黄萎、叶片卷曲、坏疽。同时，由于病毒难以侵染植物顶端分生组织，因此不能应用于植物茎尖分生组织的研究。

相对于PVX、TMV 和TGMV 载体，烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)除具有宿主广泛特点外， 还具有很多其它优点，如仅导致比较温和的症状，能够感染侵入区的大量细胞，能够侵染分生组织，因而被认为是一种最有潜力的VIGS载体(Ratcliff et al., 2001; Liu et al., 2002; Wu et al., 2011; Bachan and Dinesh-Kumar, 2012)。目前，基于TRV的VIGS载体系统广泛用于拟南芥、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、 番茄(Wang et al., 2006; Ho et al., 2009; Wu et  al., 2011; Bachan and Dinesh-Kumar, 2012)。

TRV是由正义和反义链2部分RNA组成的杆状病毒。RNA1编码2个复制酶和半胱氨酸富集蛋白。RNA2编码包壳蛋白和2个非结构蛋白。由于TRV RNA1在RNA2缺乏条件下能在植物体内复制和移动，因此学者们认为能够对RNA2进行改造而适宜插入目标基因片段，从而沉默目的基因。在该理论指导下，学者们利用农杆菌T-DNA构建了双价表达载体，分别携带有35S启动子和RNA1以及RNA2 (Ratcliff et al., 2001; Liu et al., 2002)。35S组成型启动子启动病毒基因组的起始转录，保证病毒快速感染植物。在RNA2中，利用多克隆位点取代编码非结构蛋白的区域，用于插入外源片段(图 1)。在VIGS载体中插入的外源片段长度及序列均影响VIGS沉默效率。一般认为插入的片段大小为150~500 bp为宜，且插入片段与目的基因同源性越高，特异性越强越好。而对于多基因家族的目标基因，最好选用保守域。

除上述的RNA病毒载体外，现在还开发有多种DNA病毒载体，包括番茄金色花叶病毒(tomato golden mosaic virus, TGMV) (Kjemtrup et al., 1998)、大白菜曲叶病毒(cabbage leaf curl virus, CbLCV) (Turnage et al., 2002)及非洲木薯花叶病毒(african cassava mosaic virus, ACMV) (Turnage et al., 2002; Fofana et al., 2004)，已分别被应用于烟草、拟南芥和木薯的基因沉默研究。另外还有一类应用较少的卫星病毒载体，一个是由TMV的卫星病毒构建成的SVISS系统(Gosselé et al., 2002)； 另一个是由中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的伴随卫星分子DNAmβ构建成的病毒载体(Cai et al., 2007)。

虽然各种载体都有成功的应用案例，但由于不同载体的宿主范围有限，而且沉默的效果也有所差异。因此，在VIGS技术应用过程中，应选择重复性好，侵染能力强，伴随的不良性状少的载体。

图 1 TRV VIGS 载体示意图

 3 VIGS载体选择标记

由于VIGS载体通常只侵染部分组织器官或者仅沉默部分基因，致使植株表现为嵌合体，因此优良报告基因是评价和改进沉默效果，确定沉默位点的有效工具。抑制八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase gene, PDS)基因表达，导致合成的胡萝卜素含量较少，植株表现为光漂白(photo bleaching)。因此早期研究中，用空载病毒载体接种植物作为阴性对照，利用PDS基因作为报告基因评价 VIGS 效果。用PDS作为报告基因的不利方面为PDS和绿色植物光合系统紧密相关，沉默PDS导致不利的表型。因此，又开发绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作为报告基因，克服对绿色植物的影响(Burch-Smith et al., 2006)。而在植物花器官的发育中，由于黄酮途径的关键基因影响植物花色，因此也可以利用查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)等基因作为报告基因(Chen et al., 2004)。当前，在水稻等植物中发现了一 些斑点叶，相关的基因如Spl7、Sp30将来也有望开发成相关的标记基因(Yamanouchi et al., 2002)。

4 VIGS技术在植物基因功能研究中的应用

VIGS技术自开发以来，广泛用于番茄、拟南芥、 烟草、矮牵牛等植物生长发育、代谢调控、抗病反应等相关基因的功能分析。在番茄中，利用VIGS技术鉴定了NbCA1、NPR1、TGA1a、MEK1、MEK2及NTF6等多个抗病相关基因的功能(Liu et al., 2002; Wang et al., 2006)，谷氧还原蛋SlGRX1在抗旱、抗盐等过程中的作用(Guo et al., 2010)。在烟草中，利用VIGS方法证实NbHSP90c-1、NbHSP70c-1、WIPK和SIPK这些基因在抗病中的作用(Maimbo et al., 2010)，探讨了依赖ABA的耐旱途径(Re et al., 2011)。在花器官发育方面，利用VIGS研究了开花相关的基因FCA和FY，花器官形成相关基因AP3和DEFICIENS (Kramer et al., 2007)。

5 VIGS技术的局限性

虽然VIGS作为基因功能研究工具有以上诸多优点，但同时也存在着不足之处。概括起来有以下几点：(1)当前的一些VIGS载体宿主范围狭小，主要集中于番茄等茄科植物中(Wang et al., 2010)。(2) VIGS很少能完全抑制一个目标基因的表达，对某些基因， 特别是多基因家族基因，VIGS虽然能抑制部分转录本，但还有部分转录本能产生大量功能蛋白，从而表现出相应性状(Zheng et al., 2010)。(3) VIGS 可能沉默高度同源的非靶基因，因此，若只需要沉默某一特异基因，需要知道该基因的完整序列。(4)遗传不稳定，当前VIGS主要应用于当代，难以用于应用研究和用于植物苗期早期基因表达的研究。而且VIGS技术重复性差，在不同时间点、不同实验、不同植株中， 实验结果差异比较大(Zheng et al., 2010)。

6 展望

当前，植物分子生物学已经进入后基因组时代，随着基因芯片技术，转录组测序技术的大规模发展使植物功能基因组学研究成为植物分子生物学热点。VIGS技术凭借其快速、简单和高效的特点，逐渐成为植物基因功能研究和高通量功能基因组学的强有力的工具，但由于当前VIGS技术的局限性，必须突破现有技术基础。首先，在VIGS载体上，需开发更多载体，建立适合更多寄主范围并使用高通量分析的VIGS体系，特别是建立适合水稻、玉米、油菜、小麦等重要粮食作物的VIGS体系。其次，开发新的无毒害、直观的筛选标记，建立适合植物早期发育研究的VIGS体系。再次，提高沉默靶基因的特异性和有效性。从而使VIGS技术更加广泛应用于植物功能基因研究。

作者贡献

李小龙完成综述的主要框架；许本波完成主要修改任务；其他相关作者完成审阅并提出修改意见。

致谢

感谢“863”计划项目“强优势油菜杂交种的创制与应用”(2011AA10A104)的课题支撑；感谢加州大学戴维斯分校的Caizhong Jiang教授对从事VIGS研究工作的指导。

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