开花是植物生长发育过程中最重要的生理过程，这一过程涉及发育方式的转换、花器官的发生和发育，以及在外界环境条件的作用下，生理生化信号的产生、传递和相互作用等(雍伟东等, 2000, 科学通报, 45(5): 455-466)。不同植物开花有4条不同的途径，分别是：依赖光周期的开花途径、自主开花途径、依赖春化的开花途径和赤霉素途径(He and Amasino, 2005)。FLC (FLOWERING LOCUS C)属于MADS-Box基因，它编码的MADS-Box转录因子对拟南芥成花具有抑制作用(Michaels and Amasino, 2001)。自主开花途径和依赖春化的开花途径都通过负调控FLC的表达，起始植物开花的生理过程(He and Amasino, 2005)。 FLC基因处在这2条途径的交汇处，可见FLC基因在植物开花过程中有重要的地位。杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是我国传统的名贵中药材，有二千多年的药用历史(杜红岩, 2003)，属于杜仲科(Eucommiaceae) 杜仲属(Eucommia)，是杜仲科中仅有的一个种，为第三纪孑遗植物。杜仲又是极具潜力的温带胶源树种，杜仲胶属于反式-聚异戊二烯，具有传统顺式-聚异戊二烯橡胶所不具有的优良特性(张继川等, 2011)。杜仲研究具有较高的经济价值，而且在研究被子植物系统演化以及中国植物区系的起源等诸多方面有重要的科学意义(杨峻山等, 1997)。杜仲的MADS-Box 基因在NCBI上还未见报道，本文拟通过RACE (rapidamplificationof cDNAends) 技术克隆杜仲的FLC基因的cDNA全长序列，旨在为杜仲的繁育和研究被子植物 系统演化中MADS-Box基因的演化提供理论基础。

1 结果与分析

1.1 杜仲目的基因克隆

提取的杜仲雄花总RNA质量满足RACE试剂盒对RNA的要求，电泳检测可见清晰的28S RNA和18S RNA条带，且28S的宽度与亮度约为 18S的两倍(图1A)。反转录后，通过3'-RACE扩增获得目标条带，大约为760 bp (图1B)。将目标条带连入T载体并转入大肠杆菌，挑取阳性菌落，摇菌提取质粒。双酶切位点在空T载体上间隔约100 bp，插入片段约760 bp。提取阳性菌株的质粒，双酶切后较小的片段大约为860 bp，符合预期大小(图1C)。

1.2 碱基序列分析

将测序得到的目的基因3'端序列和转录组库中的序列拼接，通过重叠区域确定目的基因的cDNA序列为872 bp，开放阅读框位置在 127~387 bp共261 bp，编码86个氨基酸(图2)。基因命名为EuFLC1。

EuFLC1基因其开放阅读框长度不到cDNA长度 的1/3，只编码86个氨基酸的小蛋白，这在同类基因中较为少见。但NCBI中也有报道类似的序列，其开放阅读框占cDNA长度的比例较小，编码的蛋白较小(表1)。

1.3 EuFLC1 蛋白中氨基酸性质分析

利用Protean软件分析EuFLC1的86个氨基酸， 出现频率最高的4种氨基酸分别是：Arg (13.95%)、 Val (10.47%)、Lys (9.30%)和 Ser (8.14%)。带电荷氨基酸36个(41.86%)，占总分子量的48.99%。酸性氨基酸10个(11.63%)，占总分子量的12.20%；碱性氨基酸20个(23.26%)，占总分子量的28.98%。疏水性氨基酸有27个(31.40%)，占总分子量的29.38%。极性氨基酸有17个(19.77%)，占总分子量的17.79%。

1.4 EuFLC1蛋白性质预测

用ProtScale软件和ProtParam在线软件分析， EuFLC1蛋白分子量约为10.005 kD，理论PI为10.47， GRAVY为-0.553，说明其为亲水性蛋白(图3A)。在细胞内的pH条件下，该蛋白整体带正电，利于结合到带负电的核酸上。NetPhos对EuFLC1的预测结果显示目标蛋白可能的磷酸化位点是15、22、36位的丝氨酸(图3B)，得分分别是：0.932、0.996、0.905。将EuFLC1的N端甲硫氨酸去除，保留的氨基酸序列为EuFLC1前体蛋白。用TMHMM在线分析软件预测EuFLC1前体蛋白的跨膜区(图3C)。预测结果显示，EuFLC1不存在跨膜螺旋，其不属于跨膜蛋白。

1.5 EuFLC1蛋白定位信号预测

使用SignalP在线预测分析EuFLC1前体蛋白的信号肽，结果显示(图4A)：自然分裂位点分值(C-score) 的峰值0.113在第52位，组合分裂位点分值(Y-score)的峰值0.111也在第52位，而信号肽分值(S-score)在N端无明显峰值，综合分析认为目的蛋白中不存在信号肽。用NLStradamus对EuFLC1蛋白氨基酸序列进行分析，目的蛋白存在可能的核定位信号(nuclear localization  signal,  NLS)，序列为5K VEIKRIENKSKRQVAFSKRRNGLMKK31 (图4B)。用NetNES对EuFLC1蛋白氨基酸序列进行分析(图4C)，结果显示目的蛋白的中部存在一个可能的核输出信号(nuclear export signal, NES)，序列为35LSVLCDV41。

1.6 EuFLC1蛋白二级结构分析

PSIPRED在线对EuFLC1分析的结果显示，目的蛋白二级结构中包含2个α螺旋(α-helix)和4个β折叠(β-strand)，无规卷曲(randon coil)连接α螺旋及β折叠(图5)。

1.7 EuFLC1蛋白三级结构分析

SWISS-MODEL以肌细胞特异性增强因子2B(myocyte-specificenhancerfactor2B)为模板，对EuFLC1蛋白三级结构进行同源建模，EuFLC1蛋白包含2个互相垂直的α螺旋，α螺旋间有2个处于同一平面β折叠，蛋白的N端和C端为无规卷曲并伸向整体结构的一侧(图 6)。

1.8 EuFLC1蛋白功能预测

经NCBI的Conserved Domain Database的分析， EuFLC1具有MADS-Box家族亚科中MADS_MEF2_like的特征结构域(图7)，表明EuFLC1是MADS-Box基因 。MADS-box基因分为Ⅰ和Ⅱ两种类型(Al varez-Buyllaetal., 2000)，根据EuFLC1包含MEF2_like类型的MADS-box区结构域，将其归为Ⅱ型。

Protein blast结果中，与EuFLC1同源性较高的序列为 ：葡萄(Vitis vinifera) 的flowering locus C (NP_001268057)、小粒种咖啡(Coffea arabica)的MADS-box protein FLCsubfamily(ADU56823)、巨峰葡萄(Vitis labrusca ×Vitis vinifera)的 floweringlocus C-like MADS-box protein (ABR68644) (图8)。据此判断EuFLC1基因行使类似FLC基因的功能，调控开花时间。

1.9 EuFLC1蛋白氨基酸序列进化树分析

分析NCBI 中已报道的所有FLC蛋白序列，选取已报道的每个种属中具有代表性的、氨基酸序列完整的一个序列作为数据源，以此构建系统发育树(图9)。结果显示，在被子植物中FLC最初进化为2个分支，一支主要是草本植物，另一支主要为木本植物。在木本植物的分支中进一步分为2个分支，其中一支包括杜仲和小粒咖啡。这说明二者的亲缘关系较近，同时在系统进化上较为原始。在APGⅢ分类系统 (Bremer et al., 2009)中，杜仲属于绞木目(Garryales)， 小粒咖啡属于龙胆目(Gentianales)，同属唇形类植物 (lamiids)，这与 EuFLC1的系统发育树的结果一致。山萮菜(Eutrema wasabi)、芥菜(Capsella rubella)、白荠 (Sinapis alba)、盐芥(Eutrema halophilum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、白菜(Brassica rapa)、油 菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、萝卜(Raphanus sativus) 都是十字花目(Brassicales)植物，在发育树中聚在一个分支上。大豆(Glycine max)是豆类植物(fabids)，独 立一支，与十字花目植物分支并列。可可(Theobroma cacao)、枳(Citrus  trifoliata)、胡桃(Juglans  regia)、山核 桃(Carya  cathayensis)、娑罗双(Shorea  beccariana)、葡萄、白桦(Betula platyphylla)分属于豆类植物(fabids)、 锦葵类植物(malvids)和葡萄目(Vitales)的植物，聚在一个大的分支上，与唇形类植物分支并列。系统发育树中，除杜仲和小粒咖啡是菊类植物(asteroids)，其它均为蔷薇类植物(rosids)。

2 讨论

杜仲是第三纪孑遗植物，与它同时期的大部分植物都已灭绝(杨峻山等, 1997)。杜仲胶属于反式-聚异戊二烯，目前仅已知我国特有的杜仲(张继川等, 2011)、 东南亚热带雨林里的古塔波树(Palaquium gutta) (Bamba et al., 2001)和南美热带雨林里的巴拉塔树(Mimusops balata) (Lovering, 1970)等少数植物能够合成反式-1,4-聚异戊二烯，因此国际上杜仲胶又被称作古塔波胶或者巴拉塔胶。已知约2 500种植物会产生橡胶(Mooibroek and Cornish, 2000)，但它们合成的是顺式-聚异戊二烯，说明杜仲具有特殊的胶合成基因。一些杜仲次生代谢相关基因已被克隆并进行了研究(周明兵等, 2003; 赵丹等, 2012; 刘攀峰等, 2013)，基因序列相似性都没有超过 87%。

MADS-Box基因是植物中重要的基因家族之一，但对杜仲的此类基因克隆和研究还未见报道。本研究克隆的EuFLC1基因和NCBI上已报道的FLC基因有较大的差异，表现在开放阅读框的长度较短、 占mRNA的比重较小。花发育相关的MADS-Box基因包含约180 bp的 MADS-box区以外，还含有1个约 90 bp的Ⅰ-box区，1个约210 bp的K-box 区和1个比较多变的C 末端( Purugganan et al., 1995 )。 这类 MADS-Box 基因被定义为Ⅱ型，其 MADS-box区为 MEF2_like型(Alvarez-Buylla et al., 2000)。根据MADS-box区进行分类，含有 MEF2_like型 MADS-box区的EuFLC1是花发育中的Ⅱ型 MADS-Box 基因。植 物的Ⅱ型 MADS-Box 基因又被分为MIKCC 型和 MIKC* 型，但 2 者均包含 K-box(Henscheletal., 2002)。 EuFlC1不包含K-box 和比较多变的C末端，不属于这2者之一，而独立成为一类，为植物Ⅱ型MADS-Box基因中的第三类 。 动物中的Ⅱ型 MADS-Box基因不包含K-box和比较多变的C末端， 只有MEF2型一种 ，EuFLC1结构与其相同。 Theissen 等(1996)认为，在大约10 亿年前真核生物的最后一个祖先可能已经拥有至少一个真正的MADS-Box基因，MIKC型基因的最后一个祖先可能是MEF2型基因。推测动物中和杜仲中MEF2型基因保留了原始特征，现在大多数植物的 MEF2型基因为进化的结果。这表明杜仲基因处在较原始的状态，同时也在一定程度上支持了Theissen等的观点。处于原始地位的杜仲为单性植株，也在一定程度上支持了被子植物的祖先可能具有单性的生殖结构的观点(Donoghue and Doyle, 2000)。

EuFLC1蛋白有86个氨基酸，但在其Blastp 比对结果中，完整的蛋白序列有近90%包含163~254个氨基酸。出现这种情况的原因可能是杜仲是第三纪孑遗植物，基因较为原始。在Blastp比对的结果中， 拟南芥中的 MADS affecting flowering 4 variant Ⅲ和 Ⅳ是2个突变基因的产物，过表达每一个都会影响开花，功能类似FLC，起到抑制开花的作用(Ratcliffe et al., 2003)。这说明具有较短的氨基酸序列的类FLC蛋白质一样可以起到FLC的功能。EuFLC1与这2个蛋白具有一定的同源性和相似的大小，又和其它FLC有较高同源性，因此EuFLC1可能在杜仲中就 发挥着FLC的功能。

杜仲的雌雄花均无花被等复杂结构，这表明杜仲在花的进化上也表现的较为原始。AP1基因是花器官形态特征基因，其在花发育的 ABC模型、ABCD模型和ABCDE模型中均属于A类基因，是萼片和花瓣正常发育所必需的。Gustafson-Brown等(1994)发现在AP1突变体中，处在第一轮的萼片转变为叶片状结构，第二轮花器官多数不发育，而第三轮的雄蕊和第四轮的心皮则发育正常。遗传学上的研究也 显示AP1在决定花的分生组织特性和第一轮、第二轮花器官的正常发育中起作用(Haughn et al., 1995)。 杜仲无花被，且花芽的结构类似AP1突变体，因此认 为杜仲无花被的现象可能与AP1有关。如果杜仲中无AP1 基因或类似功能的基因，则其自然不会产生 花被结构。如果杜仲AP1存在，则分为2种情况。第一种情况是杜仲AP1的序列与现在AP1有较大差 异，功能有所不同。第二种情况是杜仲AP1正常，但 调控受到影响。FLC 基因通过FT基因间接调控AP1 (He and Amasino, 2005)。K-box区是是发生二聚体化 的结构基础(Krizek and Meyerowitz, 1996)，C 末端在蛋白复合体的形成和转录激活中起重要作用(Egea-Cortines et al., 1999)，EuFLC1蛋白无这两结构，可能会对杜仲AP1的间接调控产生影响。

3材料与方法

3.1材料

3.1.1主要材料

取杜仲雄花花芽置液氮中备用。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α由本实验室保存。

3.1.2主要试剂

OMEG A公司的Plant  RNA  Kit、Plasmid  Mini Kit、Gel Extraction Kit；Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit；北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T1 Cloning Kit；TaKaRa公司 的 DL2000  DNA  Maker、Competent  Cell  Preparation Kit、限制性内切酶Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ。

3.2方法

3.2.1总RNA提取

将RNA提取需要使用器皿根据材质分别用0.1%的DEPC溶液37℃浸泡12 h或200℃干热处理4 h。液氮研磨杜仲雄花样品后，按照Plant RNA Kit说明书提供的实验步骤提取杜仲雄花总RNA。将总RNA保存于-80℃冰箱中，并取5 μL样品用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的品质

3.2.2引物设计

在本实验室构建的杜仲转录组库(另文发表)中筛选与FLC基因有同源性的基因片段。Blastn比对结果显示，已知基因片段的5'端包含MADS-Box基因完整的MADS-box区，且起始密码子的位置与已 报道的同源序列相同。因此确定目标片段包含开放阅读框 5' 端的完整序列，只需克隆目的基因的3'端。 根据基因片段的序列和RACE cDNA Amplification Kit 的要求设计 3'-RACE引物，通过PrimerSelect 软件对引物及引物对进行质量检测，由上海英俊生物技术有限公司合成。GSP：5'-ATGGGGCGAAGGAAGGTGGAG-3'

3.2.3逆转录和3'-RACE

逆转录和3'-RACE均使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit完成。按照说明书提供的实验步骤反转录杜仲雄花总RNA。用GSP 和试剂盒提供的通用引物UPM作为双侧引物，按照说明书提供的实验步骤进行3'-RACE。将RACE-PCR产物保存于-20℃冰箱中，并取 5 μL样品用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RACE-PCR扩增的结果。

3.2.4连接T载体与测序

使用Gel Extraction Kit回收目标片段；把目标片段连接到pEASY-T1 Cloning Vector 上；将重组T载体用热激法导入用Competent Cell Preparation Kit制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取阳性大肠杆菌菌落液体培养，用Plasmid Mini Kit提取质粒DNA，限制性内切酶双酶切鉴定，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

3.2.5生物信息学分析

使用DNAMAN进行序列分析、序列拼接、开放阅读框查找、氨基酸翻译、多重比对，用Protean软件分析氨基酸序列，用ProtScale和 ProtParam在线软件分析分子量、理论等电点(isoelectric point, PI)、亲水性指数(grand average of hydropathicity, GRAVY)， 用NetPhos 2.0 Server在线软件分析磷酸化位点，用TMHMM Server v.2.0在线分析软件预测跨膜区，用SignalP 4.1 Server 在线预测信号肽，用NLStradamus在线预测核定位信号(nuclear localization signal, NLS)， 用NetNES 1.1 Server在线预测核输出信号(nuclear export signal, NES)，用PSIPRED在线对分析蛋白二级结构，用SWISS-MODEL在线对蛋白三级结构进行同源建模，用NCBI的 Conserved Domain Database的分析保守结构域，用Protein blast (Program: BLASTP 2.2.29+)对蛋白进行同源性比对，由MEGA 6软件根据相邻连接方法(Neighbor Jointing, NJ)建立系统发生树。

作者贡献

高源隆是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成数据分析，论文初稿的写作；董旋参与实验设计和实验研究；赵德刚教授是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。 全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家863计划“特色植物功能基因组学研究与应用”子项目“特色林木功能基因组学研究 与应用”子课题“ 杜仲功能基因组研究与应用” (2013AA102605-05)资助，在此表示感谢！

参考文献

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