丝状真菌中产孢机制的研究主要集中在两种模式真菌构巢曲霉和粗糙脉孢菌上，并且对其无性产孢的机理研究得比较清楚，而对有性产孢的报道则比较少。由于构巢曲霉等大部分丝状真菌在自然及诱导条件下都很难得到纯的有性发育阶段，而与谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var. intermedius)相比，其它真菌具有一些独特的优势，该菌在不同的渗透压条件下产生两种截然不同的孢子，在低渗透压下只产生子囊孢子，随着渗透压增大，子囊孢子产生量逐渐减少，最终只产生分生孢子(刘作易等, 1991, 西南农业学报, 4(1): 73-76)，因此是研究产孢机制的良好材料。

YchF是一个高度保守的GTPase，属于Obg蛋白家族。该家族的蛋白参与了压力应答、DNA复制、孢子形成以及形态发育等(Michel, 2005)。在原核生物中YchF功能相当于依赖GTP的翻译因子，作为核蛋白复合体的一部分参与翻译过程(Caldon and March, 2003)。在酵母中与YchF同源的YBR025c被H₂O₂诱导表达(Godon et al., 1998)，在细胞应对氧压应激反应时，通过与26S蛋白酶体相互作用参与受损蛋白质的降解(Verstraeten et al., 2011)。同源的水稻YchF1(Cheung et al., 2008)和人类OLA 1( 张佳炜, 2009)的功能分别是作为压力应答和细胞抗氧化反应制的一个负调控因子。而本研究所采用的材料谢瓦氏曲霉间型变种的产孢也是通过渗透压为主导、温度和光照等外界环境压力所调控的，所以推测此类蛋白有可能在产孢调控中发挥一定作用，且目前YchF在丝状真菌中的功能方面的信息几乎是空白，因此该基因的研究具有十分重要的意义。

谢瓦氏曲霉间型变种是茯砖茶加工“发花”过程中的优势菌种，其数量和质量常被用来判断茯砖茶品质的优劣。目前国内对于该菌的研究仅限于生理、生化特性，为了达到改善茯砖茶品质，提高其经济价值的目的，就必须深入理解谢瓦氏曲霉间型变种产孢的分子机制，以便人工有效控制茯砖茶的品质。为深入了解谢瓦氏曲霉间型变种产孢的机制，分离该菌差异表达的基因就成为一种有效的手段。本研究从已构建的谢瓦氏曲霉间型变种抑制性差减杂交(SSH)文库中，筛选出一个子囊孢子时期差异表达的基因YchF的cDNA片段，利用RT-PCR、RACE及生物信息学方法得到该基因cDNA的全长序列并对其进行了初步分析。该实验成果为深入研究该基因在谢瓦氏曲霉间型变种中与有性发育的关系奠定基础。

1结果与分析

1.1 YchF基因的cDNA全长扩增

所提RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，28S及18S RNA条带清晰，表明所提RNA完整，符合后续实验要求。利用RACE技术扩增YchF基因的3'和5'末端，并将扩增得到的特异性条带进行回收(图1; 图2)。

1.2 YchF基因cDNA的测序及拼接

根据YchF基因5'和3'末端片段测序结果，利用Bioedit软件对这两个片段以及库中EST片段进行拼接得到YchF基因的全长cDNA序列。该cDNA全长1 367 bp，并用Bioedit软件对该基因cDNA的开放阅读框(open reading frame, ORF)进行预测，结果显示该基因的ORF有1 182 bp，含24个polyA，5'非编码区有57 bp，3'非翻译区有128 bp，开放阅读框的起始位点在58 bp处，终止位点在1 237 bp处，编码393个氨基酸残基。

1.3谢瓦氏曲霉间型变种eYchF基因及其编码蛋白质的生物信息学分析

Blast核苷酸序列同源性分析表明，eYchF与棒曲霉(Aspergillus clavatus NRRL 1)的GTP结合蛋白YchF相似度为84%。该基因含有一个长为1 182 bp的完整的ORF，利用softberry对该基因ORF编码的氨基酸序列进行推导结果表明：该基因的人ORF编码一个由393个氨基酸组成的蛋白(图3)，该蛋白分子量为43.466 9 kD，理论等电点为6.99，负电荷氨基酸(Asp+Glu)总数为54，正电荷氨基酸(Arg+Lys)总数为54，不稳定参数为33.01，属于稳定蛋白。推测该蛋白位于细胞质中。保守结构域分析发现eYchF基因编码的YchF蛋白含有一个G domain和一个TGS domain(图4)，与曲霉属其它种的YchF的结构域相符合，所以将谢瓦氏曲霉间型变种YchF基因命名为eYchF。

G domain由G1、G2、G3、G4和G5这5个不同的序列构成，而另一个TGS domain的功能目前尚不明确。

用ProtScale进行的疏水性/亲水性分析：脂肪族氨基酸指数(aliphatic index)为92.32，YchF蛋白的平均亲水系数(GRAVY)为-0.282，因此，该蛋白为亲水蛋白(图5)。

2讨论

通过对YchF序列的生物信息学分析，发现其作为一个GTPase，从保守结构域上看，含有一个定位在N端的G domam和一个定位于C端的TGS domam。G domain含有从G1到G5五个特征序列，参与核苷酸的结合及水解(Sprang et al., 1997)。这五个序列在所有的GTPase中都相对比较保守。G1序列(GLANVGKS)也被称为P-loop(Saraste et a1., 1990)，G2也被称为switchⅠ，其特征是一个保守的苏氨酸T，G3(DIAG)序列被称为switchⅡ，switchⅠ和switchⅡ发挥着分子开关的作用，与GTP结合时，蛋白被激活，进而发挥功能；与GDP结合时，蛋白就失活(Vetter and Wittinghofer, 2001)。G4序列为NLSE，G5序列为ISA。这些保守结构特征证实扩增序列正确，为今后对YchF的进一步研究奠定了基础。

近年来，由于假阳性率低、特异性较高、背景低等优点(Wan et al., 2002; Rebrikov et al., 2004)抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)被广泛应用于研究基因的差异表达(Huang et al., 2007)。而本研究是从谢瓦氏曲霉间型变种抑制性差减杂交(SSH)文库中筛选出一个基因编号为A0128.860的EST序列，该基因为子囊孢子时期差异表达，推测该基因可能在谢瓦氏曲霉间型变种的有性发育过程中发挥一定的作用，因此利用同源重组敲出谢瓦氏曲霉间型变种的YchF基因，看ΔYchF突变体对谢瓦氏曲霉间型变种产孢过程究竟产生什么影响，成为我们下一步研究的目的。

3材料与方法

3.1菌株, 培养基及试剂

谢瓦氏曲霉间型变种(菌株GZAAS20.1004)由贵州省农业生物技术重点实验室保存，E. coli感受态菌株DH5α购于美国Invitrogen公司。

固体培养基：Malt Extract 20 g、Yeast Extract 5 g、蔗糖30 g、NaCl 50 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 mL。液体培养基：Malt Extract 20 g、Yeast Extract 5 g、蔗糖30 g、NaCl 50 g、蒸馏水1 000 mL。

Trizol RNA提取试剂盒、pMD19-T载体及PCR试剂购于大连宝生物公司；3' RACE和5' RACE试剂盒购自Clontech公司；离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根公司；引物合成由上海捷瑞生物公司完成。

3.2菌丝培养及诱导产孢

接种子囊孢子悬液于液体培养基中，28℃，220 r/min，摇床培养6 d左右。收集菌丝，再转接于固体培养基培养18 h诱导产孢，收集产孢初期的菌丝体备用。

3.3 RNA提取

按照TaKaRa公司RNAiso Plus试剂盒说明书进行谢瓦氏曲霉间型变种总RNA的提取。

3.4 YchF基因cDNA全长的克隆

3.4.1反转录及3' RACE和5' RACE cDNA的扩增

反转录以谢瓦氏曲霉间型变种产子囊孢子初期的总RNA为模板，按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit说明书进行合成。从本实验室已构建的谢瓦氏曲霉间型变种抑制性差减杂交(SSH)文库中，筛选一个表达序列标签A0128.860，以其序列为模板，利用软件Primer Premier 5.0设计基因特异性引物(gene specific primer, GSP)及其巢式引物(Nested GSP, NGSP)序列，分别用于3' RACE和5' RACE的扩增。引物信息如下：

GSP1：5'-CCGTCGTGGTGGTCAGACTTTGGAG-3'；NGSP1：5'-AGGAGGGTCACGATGTCCGCAAG-3'；GSP2：5'-CTCGCTAAGGTTGACGAGGTAACG-3'；NGSP2：5'-CCAGTCACCCTTGCGGACATCGT-3'。

通用引物10×Universal Primer A Mix(UPM)由试剂盒提供，基因扩增操作均按Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。反应体系(50 μL)：3'/5'-RACE-Ready cDNA 3 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，10×UPM 5 μL，ddH₂O 15 μL，GSP引物2 μL。反应程序：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min 30个循环。

3.4.2 PCR产物克隆测序

扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收，然后克隆到pMD-19T载体，并转到E. coli DH5α感受态中，筛选重组子，菌落PCR验证后送北京诺赛基因公司测序。

3.4.3 YchF基因全长拼接及生物信息学分析

根据YchF基因5' RACE和3' RACE测序结果，利用Bioedit软件对这两个片段以及库中EST片段进行拼接，将拼接得到的YchF基因的cDNA的全长序列用Bioedit软件和ORF finder进行ORF的预测。并用在线数据库(http://cn.expasy.org/tools/)分析谢瓦氏曲霉间型变种YchF基因的cDNA的全长序列的性质，推导该种的YchF的氨基酸序列。

作者贡献

李孝霞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；李孝霞及谭玉梅完成数据分析和论文初稿的写作；刘永翔参与实验设计和试验结果分析；刘作易是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析及论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究得到了黔农科院专项([2011] 037号)的资助。作者感谢贵州省农业生物技术重点实验室的所有工作人员以及研究生同学在日常的工作和学习中给予的帮助和关心。

参考文献

Caldon C.E., and March P.E., 2003, Function of the universally conserved bacterial GTPases, Curr. Opin. Microbiol., 6 (2): 135-139

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Godon C., Lagniel G., Lee J., Buhler J.M., Kieffer S., Perrot M., Boucherie H., Toledano M.B., and Labarre J., 1998, The H₂O₂ stimulon in Saccharomyces cerevisiae, J. Biol. Chem., 273 (35): 22480-22489

Huang X., Li Y., Niu Q., and Zhang K., 2007, Suppression sub- tractive hybridization (SSH) and its modifications in micro- biological research, Appl. Microbiol. Biotechnol., 76 (4): 753-760

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Rebrikov D.V., Desai S.M., Siebert P.D., and Lukyanov S.A., 2004, Suppression subtractive hybridization, Methods Mol. Biol., 258: 107-134

Saraste M., Sibbald E.R., and Wittinghofer A., 1990, The P-loop a common motif in ATP-and GTP-binding proteins, Trends Biochem. Sci., 15(11): 430-434

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Zhang J.W., 2009, Functional characterizations of the gene product-OLAl, Dissertation for Ph.D., College of Medicine, Zhejiang University, Supervisors: Zheng S., and Shi Z.Z., pp. 67-72 (张佳炜, 2009, 基因OLA1(obg like ATPase 1)的蛋白功能研究, 博士学位论文, 浙江大学医学院, 导师: 郑树, 施正政, pp.67-72)