乙醇发酵所使用的酿酒酵母工业菌株发酵性能仍存在不足(陈英等, 2013; 张水龙等, 2013)，利用基因组的序列信息可以指导菌株基因的改造，有望获得发酵性能更加优良的酿酒酵母工业菌株。然而由于传统测序方法成本高昂(Kellis et al., 2003)，酿酒酵母工业菌株基因组的报道有限，对野生型工业酿酒酵母菌株基因组的研究更少，仅有少数酵母工业菌株如JAY291 (Argueso et al., 2009)、EC1118 (Novo et al., 2009)、AWR-I1631 (Borneman et al., 2008)、Lalvin QA23、AWR17-96、Vin13、FostersO、FostersB、VL3  (Borneman  et  al., 2011)、K7 (Akao et al., 2011)基因组测序有文献公布。 新一代测序技术的兴起使得测序的成本大大的降低 (秦楠等, 2011)，Illumina公司Miseq是一种小型新一代测序仪，读长可达到2×250 bp，约一天时间完成一次高通量测序，最大数据采集量达 8 Gb，可应用于小型基因组测序(Loman et al., 2012; Guan et al., 2012)。利用Miseq，已经成功进行了益生菌Lactobacillus casei Zhang (白梅, 2012)、流感病毒influenza A和influenza B (Rutvisuttinunt et al., 2013)等微生物菌株的测序。 目前国内外尚无关于工业酿酒酵母Miseq测序方法的详细报道，我们开展了野生型工业酿酒酵母菌株Miseq测序方法的研究，并利用该方法对酿酒酵母野生型工业菌株MF1002进行基因组测序，现报道如下。

1结果与分析

我们对酿酒酵母野生型工业菌株测序方法的研究从两方面着手，包括利于测序后的基因组分析和测序条件的优化，主要研究：制备分离a型和α型交配型的单倍体菌株、采用电泳和分光光度法方法监 控基因组文库建立、优化上机文库浓度后测序。

1.1 a 型和á型交配型单倍体菌株的制备分离

酿酒酵母野生型工业菌株通常为二倍体，为了简化测序后的数据分析，必须先制备、分离野生型工业酿酒酵母的单倍体，利用单倍体测序。我们利用McClary产孢培养基培养MF1002制备分离单倍体， 待MF1002生成孢子后利用酶解从孢子囊中分离得到游离的单个孢子，将酶解后的细胞稀释涂布平板，得到单孢子形成的a型和α型交配型单倍体。采用PCR方法对酵母交配型进行鉴定，MAT-F引物序列位于MAT基因座右侧，MAT-α引物是位于MAT-α和HMR-α内的一段特异性引物序列，MAT-a引物是位于MAT-a和HMR-a内的一段特异性引物序列， 使用这三条引物进行PCR扩增酵母基因组DNA，a型酵母细胞PCR鉴定产物为544 bp，α型酵母细胞PCR鉴定产物为404 bp，二倍体酵母细胞同时具有544 bp和404 bp两 PCR鉴定产物(图 1)。

图 1 MF1002单倍体PCR鉴定

1.2 采用电泳和分光光度法方法监控基因组文库建立

测序文库建立的主要步骤依次为：基因组DNA的提取和纯化、基因组DNA的片段化和纯化、将片段化后的基因组DNA加接头和纯化。由于测序试剂盒较为昂贵，必须对测序文库进行质量监控，对文库的质量评估的基础上再进行下一步的操作，通过测序文库的质量监控可以保障测序的成功率，从而节约试剂。在Illumin公司设计的Miseq测序方法中，对文库质量监控使用Agilent公司的2100生物分析 仪(Illumina, 2013)。我们设计了一个利用实验室常用方法、花费少、简便的文库质量监控方法。具体方法为：分别对提取基因组 DNA、片段化纯化后的DNA产物和添加标签后纯化的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，并用NanoDrop 2000C微量分光光度计测定 DNA 浓度。图2是提取纯化后的MF1002菌株基因组DNA。片段化后纯化产物采用用微量紫外分光光度计测定样品浓度在3.0~4.5 ng/μL之间。

按照实验操作方法(Illumina, 2013)对片段化的DNA加接头、扩增和纯化，终产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，产物8~10 μL即可明显分辨电泳DNA条带大小。经检测，文库终产物DNA的大小在250~850 bp范围内，主要片段集中在350~550 bp长度范围内(图 3)，通NanoDrop 2000C微量分光光度计测定样品DNA浓度在7~13 ng/μL范围内。

图 2 MF1002菌株基因组DNA

图 3 建成文库的电泳检测

1.3 优化上机文库浓度后测序

Miseq上机检测的文库浓度是影响测序结果的主要因素。我们使用10 pM、20 pM两种浓度MF1002文库进行上机测序，按照Miseq测序要求对测序结果进行判断 ，Miseq测序数据>=Q 30值必须高于75%，测序数据应采集2 Gb以上(Fernandez-Mercado et al., 2013)。结果如图4 (MiSeq测序软件 MiSeq Control Software的测序监视图)，两种不同浓度文库 测序的>=Q3值分别为91.0%和 90.0%，均高于75%。 而当文库上机浓度为10 pM时，测序形成簇的数量为178 k/mm2，测序采集总数据量为1 Gb (图 4A)，小于2 Gb；当文库上机浓度为20 pM时，测序形成簇的数量为597 k/mm2，采集数据总量为3.5Gb(图4B)，说明MF1002测序文库浓度条件20 pM优于10 pM。

图 4 不同上机文库浓度测序时采集数据比较

2 结论

我们自建了野生型酿酒酵母工业菌株Miseq测序方法，经过MF1002基因组测序和其它菌株基因组测序(数据未列出)显示，该方法为一个有效的野生型酿酒酵母工业菌株测序方法。酿酒酵母是一种重要的模式生物，其实验室菌株S288C在1996年成功完成测序(Goffeau et al., 1996)。如将不同性状酿酒酵母工业菌株进行测序、分析，可以从全基因组的角度对酿酒酵母的改造提供指导(秦楠等, 2011) ，然而由于传统的测序方法成本高昂，工业酿酒酵母的基因组测序直到2008年后才开始见到报道(Borneman et al., 2008)。Miseq测序仪是新一代的小型测序仪，可应用于小型基因组测序，规模不大的实验室也能承受其购买和运行费用(Loman et al., 2012; Guan et al., 2012)，酿酒酵母工业菌株Miseq测序方法缺乏详细报道，我们建立的测序方法将推动酿酒酵母工业菌株基因组研究，进而推动酿酒酵母工业菌株改造，有利于提高乙醇发酵生产。

Miseq基因组测序平台测序文库的质量控制直接关系到后期的数据质量，因此显得尤为重要。本研究采用琼脂糖凝胶电泳的方法以及浓度测定相结合的方法直接进行质量分析，利用简单、便宜的方法对文库的质量评估的基础上再进行下一步的操作，相对于前人报道使用的Agilent公司的2100生物分析仪检测法(Quail et al., 2012)，既节约试剂、又减少了实验盲目性。经过研究，我们还确定了野生型酿酒酵母工业菌株Miseq测序的重要条件：基因组片段化产物的大小一般控制浓度在3.0~4.5 ng/μL 之间；加标签后文库的回收产物大小控制在250~850 bp左右，主要集中于350~550 bp范围内，且浓度在7~13 ng/μL之间，测序文库的浓度为20 pM，本方法可作为大范围开展酿酒酵母工业菌株基因组测序参考。

3材料与方法

3.1实验菌株

用于测序菌株为酿酒酵母(S.cerevisiae)甘蔗糖蜜酒精发酵高产野生型工业菌株MF1002，从甘蔗糖厂的废弃物中筛选得到(陆琦等, 2010; 熊雅兰等, 2014)， 由国家非粮生物质能源工程技术研究中心提供。

3.2酶和主要试剂

rTaq酶购自TaKaRa公司，Nextera DNA Sample Preparation  Kit、Nextera  Index  Kit、Phix  Control  V3、 MiSeq Reagent KitV2 (300 cycles)购自于Illumina公司、DNA纯化与浓缩试剂盒DNA Clean & Concentrator购自Zymo Research公司 ，Agencourt AMPure XP Kit购自Beckman公司 ，PCR引物由invitrogen公司合成。

3.3培养基

YPD培养基：酵母提取物含量1%、蛋白胨含量2%、葡萄糖含量2%，固体培养基添加2%琼脂，自然pH，121℃、20min条件下灭菌，葡萄糖在115℃、20 min条件下单独灭菌后加入。McClary生孢培养基(Nishida et al., 2004)：葡萄糖含量0.1%、KCl含量0.18%、NaAc含量0.82%、酵母提取物含量0.25%、琼脂含量2%，自然pH，121℃、 20 min条件下灭菌。

3.4酿酒酵母菌株生孢

将菌株接种入YPD液体培养基，在220 r/min、 30℃条件下过夜活化两次，再培养8~12 h至对数期，取1.5 mL EP管，将菌体在12 000 r/min 30s条件下离心收集，用无菌水洗两次，用1mL无菌水重悬菌体，取300 μL涂布McClary生孢培养基，在 30℃培养箱中培养3~5 d，每天刮取少量菌体在显微镜下镜检并记录生孢情况(汤二将等, 2012)。

3.5酵母单倍体的分离

在酵母生孢率达到95%以上时，用接种环刮取菌体至装有1 mL无菌水的EP管中，在12 000 r/min、 30 s条件下离心收集菌体，用0.1 % β-巯基乙醇在37℃条件下处理细胞45 min，收集菌体，加入蜗牛酶与纤维素酶脱壁酶液[蜗牛酶: 纤维素酶(V/V)=1:1，酶浓度均为4 mg/mL，用CPB高渗缓冲液配制，0.22 μm滤膜过滤除菌]在37℃条件下处理细胞24 h，每隔3 h 在显微镜下观察细胞被酶解情况。将细胞培养物梯度稀释后分别涂布YPD平板，37 ℃条件下培养1~2 d至有单菌落生成。

将单菌落分别随机挑取至McClary生孢培养基上，30℃培养3~5 d，显微镜下观察是否有孢子囊生成，将无孢子囊生成的菌株重新挑取到新的McClary生孢培养基平板上，30℃培养 3~5 d，镜检观察，将无孢子囊生成的菌株确认为酵母单倍体，将分离出的单倍体进行菌种保藏(Akao et al., 2011; Borneman et al., 2011)。

3.6酵母单倍体交配型的鉴定

根据文献所报道的PCR鉴定方法进行酵母单倍体交配型的鉴定(Smith et al., 2009)。PCR鉴定使用的引物为 MAT-F、MAT-α、MAT-a 引物，MAT-F： 5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'；MAT-α：5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3'；MAT-a：5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'。以筛选出的单倍体菌株为模板，用 MAT-F、MAT-α、MAT-a引 物进行PCR扩增，PCR条件：94℃、3 min，(94℃, 30 s; 58℃, 30 s; 72℃, 1 min30 s) 30 个循环，72℃、10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物大小，从而判断菌株的交配型。

3.7酵母基因组DNA的提取

使用YPD液体培养基培养酵母单倍体，在220 r/min、30℃条件培养过夜，收集菌体，破碎酵母细胞，经苯酚氯仿抽提后，取上清，用乙醇沉淀获得酵母基因组DNA (Zhang et al., 2012)。

3.8基因组的片段化

将Nextera DNA Sample Preparation Kit中TD、 TDE1、genomic dna在冰上溶解，在PCR管中加入20 μL基因组DNA  (浓度为 2.5 ng/μL)、25 μL TD Buffer、5 μL TDE Buffer，用枪轻轻吹吸混匀，在 20℃、 2 800 r/min条件下离心1 min，基因组片段化使用PCR仪，片断化条件：55℃、5 min；10℃、60 min。用DNA Clean & Concentrator试剂盒进行基因组片段化后的DNA纯化、回收(Illumina, 2013)。

3.9片段化DNA产物的标签添加及扩增

用标签引物：5'-GGACTCCT-3'、5'-TATCCTCT-3'在PCR中配对使用，以及用标签引物5'-TAAGGCGA-3'、5'-AGAGTAGA-3'在PCR 中配对使用，分别作为验证酵母单倍体a配型菌与α配型菌的标签引物，以20 μL纯化的片段化后基因组DNA为模板进行扩增，在PCR 管中加入标签引物各5 μL、 Nextera DNA Sample Preparation Kit中的NPM 15  μL、PPC 5 μL，混匀后在PCR仪内进行反应。 PCR 条件为：72℃ 3 min、98℃ 30 s (98℃ 10 s; 6℃; 30 s; 72℃ 3 min)5个循环、10℃ 60 min。用Agencourt AMPure XP Kit磁珠进行 PCR产物的的纯化回收，使用方法按Illumina公司推荐方法(Illumina, 2013)。

3.10文库样品变性稀释与上机测序

将经以上3.9方法处理得到的文库DNA样品稀释至3nmol/L(按平均大小500bp文库条件计算，1 ng/μL=3 nmol/L文库 DNA)，用0.1 mol/L的NaOH 10 μL加入10 μL样品中，处理5 min使文库DNA变性，稀释至上机测序所需浓度即可。将Phix Control V3 (对照)和稀释后的文库DNA加入MiSeq Reagent KitV2 (300 cycles)中，Phix Control V3 的加入量为终浓度7 pmol/L，按照Miseq测序仪操作方 法进行基因组测序(Illumina, 2014)。

作者贡献

曹德民和张穗生为共同第一作者，负责实验开展和论文撰写；黄日波为论文的通讯作者，对实验进行指导；罗贞贞负责部分实验数据采集。

致谢

感谢国家863课题(2012AA022106,2013AA050701)、国家国际合作项目(2010DFB63590)、广西科学研究和技术开发项目(桂科重12118004-2, 桂科重1348004-1, 桂科重1348004-3和桂科合1346011-4)、广西自然科学基金(2011GNSFA018113, 2012AA022106)广西八桂学者建设工程专项经费、广西科技创新能力与条件建设计划项目(桂科能12237022)、广西科学基金项目13-051-08和广西科学院基本科研业务费资助项目12YJ25SW03经费等共同资助。

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