塑料产生的烃类废物在其较长的分解期内会产生有毒的化合物，现代生活方式和人口过剩导致的自然资源消耗殆尽需要全世界合理、有效和可持续地利用环境资源，生产环保、降解周期短的塑料，例如聚羟基链烷酸(PHA)可以减少不利的废物和排放(Koller et al., 2010; Levis and Barlaz, 2013)。

在营养有限的条件下，各种细菌利用这些碳和能量产生聚酯(Liu et al., 2013)。当提供过量的碳并且限制一种基础生长营养物时，这些聚合物作为颗粒在细菌细胞质中积累(Tanamool et al., 2013)。PHA是由(R) 3-羟基脂肪酸组成的光学活性生物聚酯，代表一类复杂的生物聚合物(Martínez et al., 2012)。羟基链烷酸(Has)和聚羟基链烷酸酯单体都是R-enantiomerically纯化学品(Adkins et al., 2012)。由于PHA在物理性质上类似于石化聚合物，这些可生物降解的热塑性塑料被认为是用于石油化学衍生塑料的有前景的替代品(Poli et al., 2011)。根据单体单元的碳链长度，分为两类PHA。含有3至5个碳原子的重复单元单体的PHA被分类为短链长(SCL-) PHAs，中链长度(MCL-)PHA由6至14个碳原子组成(Gangoiti et al., 2012)。聚羟基烷酸酯单体的手性结构单元可用于合成类似抗生素、维生素、芳烃和信息素的精细化学品(Guo-Qiang, 2009)，据报道，一些聚羟基链烷酸具有抗微生物活性(Shuping, 2013; Ruth, 2007)。不同的产生PHA的生物体中，PHA生物合成基因也有所不同，PHA的生物合成基因座分为三大类，在I型系统中，PHA合酶编码基因(phb)与phbA和phbB相邻，例如真菌Ralstonia eutropha (以前的Alcaligenes eutrophus)的pha基因座，这两个基因分别编码与scl-PHA的生物合成密切相关的b-酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶。通过PHA解聚基因(phaZ)分离两个合酶基因(phaC1和phaC2)的基因座的轨迹是II型PHA遗传组织系统，mcl-PHA产生的假单胞菌具有II型系统。在III型PHA生物合成遗传组织中，合酶由phoebE和phbC基因编码的两个多肽亚基组成。phbA和phpbB基因也位于该基因座，但通常从phbE和phbC基因发散地转录，这种类型已在酒色着色菌、集胞藻属和紫囊硫菌中观察到，后来，巨大芽孢杆菌的pha基因座被定性为IV型PHA生物合成遗传系统(Hernandez-Eligio et al., 2011; Poirier et al., 1995)。在本文中，我们报道了用于在天然假单胞菌菌株中分离和扩增PHA合酶基因hdaC1的快速、灵敏的PCR程序。因为PHA合酶是细菌合成聚羟基链烷酸生物可降解聚酯所必需的关键酶，我们的主要目的是克隆天然假单胞菌中的hdaC1基因，然后在适当的宿主中表达产产生可生物降解塑料，因此代替石油衍生的聚合物。

1结果与分析

1.1 PHA产物的FTIR分析和确认

纯化的PHB，mcl-PHA和P (HB + mcl-HA)分别在FT-IR光谱1728 / cm，1740 / cm和1732 / cm处有最强峰(Shamala et al., 2009)。mcl-PHA谱图中最强的谱带是2928 / cm附近亚甲基C-H的振动。在光谱1165 / cm附近可以看到mcl-PHA的其他特征谱带(图1)。证明1728 / cm和1744 / cm之间的带是PHA的特征带(Shamala et al., 2009)。

1.2 hdaC1基因的PCR扩增

使用从恶臭假单胞菌中纯化的基因组DNA制定PCR方案。据报道，该生物体可以产生mcl-PHA。本研究获得了一个独特的540 bp的PCR产物(图2)。PCR产物的大小与侧翼为I-179L / I-179R引物对的phaC1和phaC2基因的长度一致。使用由其制造商配制用于长PCR扩增的延长酶，观察到另一个ca. 3.4kb，在phaC1和phaC2基因中侧翼分别为I-179L和I-179R并且包括整个pha Z基因退火位点DNA序列的扩增子，通过加热细菌菌落的悬浮液制备的phaC基因序列检测使用纯化的基因组DNA制定的PCR方案，结果显示甚至含有phaC1和phaC2基因的微生物的粗细胞裂解物中都可以产生特征为540 bp的PCR产物(Steinbuchel and Schlegel, 1991)。

1.3 phC1基因扩增子的序列分析

对来自天然恶臭假单胞菌样品的540 bp PCR产物进行纯化和测序(图3)。使用正向和反向引物分别对540 bp PCR片段进行纯化和测序(图4; 图5)。BLASTX使用选择的190 bp的恶臭假单胞菌pha 1基因序列作为查询产生与多于20个PHA合酶匹配的氨基酸序列(数据未显示)。与具有PHA合酶1和2的铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌等的比对具有最高的同源性。如此看来，选择用于序列分析的特定的细菌克隆含有恶臭假单胞菌pha 1基因的扩增片段。在Mega5应用中使用FASTA格式的序列构建系统发生树。

图5恶臭假单胞菌中phC1基因反向引物的序列的跟踪元文件结果 Figure 5 The result of trace metafile of sequences from reverse primer for phaC1 gene in P. putida

1.4系统发育树

Mega5应用中的ClustalW方法用于构建系统发生树，“Phylip Tree”部分给出了newick格式的系统发育树(图6)。

2讨论

因为PHA在工业、医药和农业上有众多应用，因此，对涉及生产的基因进行广泛研究是非常必要的。世界上塑料的重复使用日益增加使得全球市场到2010年为止可生物降解聚合物达到1.14亿磅。出于这样的原因，PHAs的生产是受到高度认可的科学，对聚合物的重要研究主要流向欧洲和日本，一定程度上流向美国(European Bioplastics, 2007)。具体的应用吸引了大量行业兴趣，具有物理和化学性质的新型聚合物可以仅通过控制碳源的组成来合成。重要的是要注意生物聚合物科学PHAs和跨学科性质的几个生产的经济和技术障碍使得在一领域的大规模研究充满挑战，导致科学家以一种可负担的方式生产可生物降解的聚合物。由于PHA生产的成本高，威胁到商业开发的迅速进展(Pandey et al., 2005)。最后，使得PHAs具有广泛和多样化的应用，其中医疗应用是最经济可行的。现在，随着越来越多的兴趣和在这一领域的广泛研究正在进行，PHA作为下一代具有广泛应用的潜力的环保材料出现。由于涉及PHA合成的基因和hdaC1基因的潜力在世界范围内的研究还很少，所以生产PHA和该基因是新颖的，然后将该基因转移到合适的表达载体中并在大肠杆菌中进行转化以便表达也是非常重要的。该基因与phaD和phaG基因转移到几种不同的细菌中是一个作为更多的效率和研究来增加基因表达非常好的方法。PHA合酶对鉴定其他本土细菌和大规模生产这种物质以及商业化也是非常有益的。

3材料与方法

3.1菌株及其培养条件

恶臭假单胞菌KT2442的分类特征已有报道(Hume et al., 2009)。细胞在含有25 mL Luria肉汤的100 mL锥形瓶中30℃下在旋转培养箱中以150 rpm预培养24小时[(5g / L酵母提取物, 10g / L胰蛋白胨, 5g / L NaCl) Merck Darmstadt, 德国] (Akhavan Sepahy et al., 2011)。细胞在30℃振荡培养箱(180 rpm)中在含有100 mL氮限制矿物盐(MS)的500 mL培养基中培养72小时，用于生产和提取PHA。标准矿物盐培养基(每升蒸馏水)：1.269 g CH₃CH₂OH，600 mg MgSO₄ 7H₂O，160 mg NH₄Cl，100 mg乙二胺四乙酸(EDTA)，92 mg K₂HPO₄，45 mg KH₂PO₄，70 mg CaCl₂·2H₂O和2 mL微量元素溶液。微量元素溶液(每升蒸馏水)：1500 mg FeCl₃·6H₂O，150 mg H₃BO₃，150 mg CoCl₂·6H₂O，120 mg MnCl₂·4H₂O，120 mg ZnSO₄·7H₂O，60 mg Na₂ Moo₄·H₂O，CuSO₄·5H₂O和30 mg KI，过滤灭菌的碳源也加入到培养基中(Watcharakul et al., 2012)。

3.2 PHA确认的FTIR样品制备

用于PHA的定性和定量分析，7~10 mg冻干细胞或分离聚酯在含有15％(v / v)硫酸的甲醇中进行甲醇分解。在Soxhlet装置中通过氯仿从冻干细胞中提取PHA，随后在10 vol.甲醇中沉淀，将沉淀物溶解在丙酮中，并再次在甲醇中沉淀，以获得高度纯化的PHA。将纯化的PHA溶解在氯仿中并在KRS-5窗上分层。蒸发氯仿后对PHA聚合物膜进行FTIR分析(Mai et al., 2004; Hong et al., 1999)。

3.3 PCR扩增方法

通过标准程序使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega, Madison, WI)分离总基因组DNA (Sambrook et al., 1989)。PCR在购自fermentas的Techne PCR热循环仪(Techne, England)中进行，测序引物由PCR预混合物合成，所有操作根据制造商的说明书进行。为了从恶臭假单胞菌的基因组DNA中扩增PHA合酶基因pha 1，使用两种特异性引物进行PCR，正向引物：ACAGATCAACAAGTTCTACATCTTCGAC，反向引物：GGTGTTGTCGTTGTTCCAGTAGAGGATGTC。PCR条件如下：30个循环94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟。通过1×TBE (Tris-Borate-EDTA)缓冲液中的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并用0.5 ug / mL溴化乙锭染色凝胶。

3.4核苷酸序列分析

通过正向和反向引物PCR扩增得到的phC1基因通过310遗传分析仪所述的修饰的双脱氧链终止方法测序(Tomris et al., 2007) (Perkin Elmer)。用遗传信息处理软件Bioedit分析得到核苷酸序列。扩增序列的生物信息学内容通过NCBI BLAST程序得到(Wiese et al., 2011)。

3.5系统发育树的生物信息学方法

一组同源DNA序列构建树。将来自PCR扩增的phC1基因的序列送入blastn网络中，在NCBI处将其粘贴到主搜索框中。在blastn中应用以下序列：

恶臭假单胞菌KT2442

aagagcttggtccgcttgtgctggagaacagctggcagactttcatcatccattgggggcaccccgacaactaccacgccaatggggcctgaccacctatgtcg

aggccctcaacgaggccatcgaggtcatcctgtagatcaccggcagccacgacctgaacctggtcggcgcctgctccggcg

获得匹配列表，其中选择十七个序列以构建(部分phaC1基因)的系统发生树

Pseudomonas_putida_KT2442, Pseudomonas_aeruginosa_LESB58,

Pseudomonas_aeruginosa_PAO1, Pseudomonas_aeruginosa_phaC1,

Pseudomonas_aeruginosa_B136-33, Pseudomonas_aeruginosa_DK2,

Pseudomonas_aeruginosa_M18, Pseudomonas_aeruginosa_UCBPP-PA14,

Pseudomonas_aeruginosa_strain_GS1, Pseudomonas_aeruginosa_NCGM2.S1,

Pseudomonas_denitrificans_ATCC_13867, Pseudomonas_aeruginosa_strain_DM2,

Pseudomonas_aeruginosa_strain_DM1, Pseudomonas_aeruginosa_PA7,

Pseudomonas_aeruginosa_PhaC2, Pseudomonas_aeruginosa_PhaC1,

Pseudomonas_aeruginosa_strain_P5

致谢

这项工作部分得到国家遗传工程和生物技术研究所(NIGEB)的资助。

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