真菌在自然界和我们的日常生活中扮演着重要的角色。在自然界中，真菌作为分解者的生物角色，对碳和养分循环至关重要。在我们的日常生活中，食用菌是众所周知的真菌的例子。酿酒酵母，被称为面包酵母，广泛用于酿酒、烘焙和酿造。一些真菌也被称为生产者的药物，如抗生素。真菌在昆虫、动物、人类和植物中也是重要的病原体。

真菌属于真核生物的四个主要分类之一，真菌细胞包含多个亚细胞区，用于执行不同的亚细胞活动。例如，一个线粒体，这是一个封闭的膜结构，主要是用来提供细胞能量，而核是一个储存遗传材料和控制基因转录的地方。在这个过程中，我们规定在一个物种中，所有蛋白分泌到质膜外的叫分泌蛋白组。这些蛋白质包括细胞壁蛋白、细胞外基质蛋白和分泌的可溶性蛋白，其可以作为一种激素或信号分子或酶。然而，分泌途径中发挥转运功能的蛋白不包括在内，因为该类蛋白与我们对分泌蛋白的定义是不一致的(Tjalsma et al., 2000; Lum and Min, 2011a)。在活体营养真菌中，分泌蛋白作为植物和真菌直间的致病或共生的相互作用的主要负责效应是确定的(Girard et al., 2013)。腐生菌大量分泌的水解酶，如糖苷水解酶家族分解纤维素和木质复合材料(Martinez et al., 2004; Martinez et al., 2009; Murphy et al., 2011)。近年来，随着许多真菌的全基因组测序，利用计算和实验方法，对真菌分泌组的蛋白进行鉴定和分析已成为一个重要的研究课题(Bouws et al., 2008)。例如，在以下已被报道的真菌分泌蛋白组包括Aspergillus niger (Tsang et al., 2009; Braaksma et al., 2010)，Aspergillus fumigatus (Powers-Fletcher et al., 2011)，Candida albicans (Lee et al., 2003; Ene et al., 2012)，Doratomyces stemonitis C8 (Peterson et al., 2011)，Fusarium graminearum (Paper et al., 2007; Brown et al., 2012)，Irpex lacteus (Salvachúa et al., 2013)，Magnaporthe oryzae (Jung et al., 2012)，Mycosphaerella graminicola (Morais et al., 2012)，Paracoccidioides (a complex of several phylogenetic species) (Weber et al., 2012)，Penicillium echinulatum (Ribeiro et al., 2012)，Phanerochaete chrysosporium (Wymelenberg et al., 2005)，Sclerotinia sclerotiorum (Yajima and Kav, 2006)，Trichoderma harzianum (Do Vale et al., 2012)和Ustilago maydis (Mueller et al., 2008)。

两个真菌特异性分泌蛋白质组数据库，真菌分泌蛋白质组数据库(FSD, http://fsd.snu.ac.kr/)和真菌分泌的知识库(FunSecKB, http://proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php)已建成，用于搜索真菌分泌的相关信息(Choi et al., 2010; Lum and Min, 2011)。FSD是基于9个不同的程序构造，采用三层递阶辨识规则而建(Choi et al., 2010)。我们开发的FunSecKB，使用6种不同的工具从真菌的参考数据中预测真菌的分泌蛋白(Lum and Min, 2011)。不管怎样，自从FunSecKB的发布，可用真菌蛋白数据已大大增加。在这项工作中，我们描述了FunSecKB2，真菌蛋白亚细胞定位的知识库，也被称为真菌分泌和亚细胞蛋白质组知识库(2版)，即FunSecKB的扩大、更新和改进版。FunSecKB2由一个精准的协议组成，包括亚细胞信息、分泌蛋白组的预测信息和15个亚细胞蛋白组的定位信息。这种改进的真菌蛋白库预计将作为一个中央门户网站，为真菌研究和工业界的用户提供真菌蛋白的亚细胞位置信息，就是那些对利用真菌促进全球生物经济发展感兴趣的人(Lange et al., 2012)。

1数据采集与数据库的安装

1.1数据采集

所有真菌蛋白序列从UniProtKB/Swiss-Prot数据库和UniProtKB / TrEMBL数据库检索到的(2013年8月发布, HTTP://www.uniprot.org/downloads)。对UniProtKB/Swiss-Prot数据库主要包含一些非冗余蛋白序列的注释信息，这些信息是从文献的实验结果和经过鉴定的计算分析结果中获取的(UniProt, 2014)。UniProtKB/TrEMBL数据库包含有蛋白质序列相关的计算生成的注释信息和大量的蛋白功能特性。该数据集包括1 976 832个真菌蛋白序列，其中从UniProtKB/Swiss-Prot数据库获取了30859条，从TrEMBL数据库检索到1 945 973条。

1.2蛋白质亚细胞定位分配的方法

真菌蛋白序列，使用以下程序处理：SignalP (版本3和4, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Bendtsen et al., 2004b; Petersen et al., 2011), Phobius (http://phobius.binf.ku.dk/) (Käll et al., 2007), WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/) (Horton et al., 2007)和TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/) (Emanuelsson et al., 2007)，进行信号肽和亚细胞定位的预测。这些预测信息顺利通过了预先的评估，得到了真菌分泌研究界广泛应用(Min, 2010)。TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm)是用来识别具有跨膜结构域蛋白(Krogh et al., 2001)，Scan Prosite (PS-Scan, http://www.expasy.org/tools/scanprosite/)被用来扫描内质网(ER)的靶序列(序列: ps00014) (de Castro et al., 2006; Sigrist et al., 2010)。利用TMHMM预测膜蛋白，具有膜结构域的区段并不位于N-末端(70个氨基酸)却被视为真正的膜蛋白。利用SignalP (version3)对蛋白质序列进行预测，发现有一个信号肽使用，使用FragAnchor进一步识别为糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚点(http://navet.ics.hawaii.edu/~fraganchor/NNHMM/NNHMM.html) (Poisson et al., 2007)。除了FragAnchor，我们还使用本地Linux系统作为独立的工具进行数据的处理。如何通过命令的操作来控制这些分析工具的运行，通常可以在下载的“Readme”的工具包中进行查看(Lum and Min, 2013)。

真菌蛋白的亚细胞定位的类别包括：分泌蛋白、线粒体(细胞膜或无膜)、内质网(膜或腔)、细胞溶液(细胞质)、细胞骨架、高尔基体(膜或腔)、细胞核(膜或无膜)、液泡(膜或无膜)、溶酶体、过氧化物酶体、质膜和其他膜蛋白。为了给予蛋白亚细胞定位信息，在使用预测信息之前，我们要考虑UniProtKB的注释信息和我们筛选的亚细胞定位信息。对于没有注释亚细胞信息的蛋白质，它们的亚细胞定位主要是基于预测信息。我们最近的计算工具精度评价表明，对真菌分泌蛋白组预测精度最高(92.1%的敏感性和特异性98.9%)的分析工具组合是SignalP、WoLF PSORT，结合Phobius有利于对信号肽的预测，结合TMHMM有利于对膜蛋白的预测，结合PS-Scan有利于去除内质网靶蛋白(Min., 2010)。因此，分泌蛋白组分析是受限的，主要是存在人为精选的分泌蛋白，以及利用三个分析工具预测的蛋白N-端具有信号肽，但没有一个跨膜结构域或内质网导向信号。在这项研究工作中，SignaIP4代替SignaIP3以提高预测精度(Petersen et al., 2011; Melhem et al., 2013)。然而，所产生的SignaIP3对于信号肽裂解位点的预测信息仍然要比SignaIP4准确(Petersen et al., 2011)。蛋白质的亚细胞定位的详细方法如下所述。

分泌蛋白

分泌蛋白进一步划分为原的分泌蛋白、极有可能会分泌的蛋白、可能会分泌的蛋白，和弱可能分泌蛋白。原始的分泌蛋白包括在UniProtKB/Swiss-Prot亚细胞定位中被注释为“分泌”或“细胞外”或“细胞壁”的蛋白。它还包括我们研究人员从最近的文献中，手动收集的分泌蛋白。SignaLP4、Phobius和WoLF PSORT这三个预测分析工具用于分泌信号肽或蛋白质的亚细胞定位预测。极有可能的分泌、可能的分泌和弱可能的分泌蛋白通过这三个预测分析工具能够预测到会分泌或者分泌信号肽。这些蛋白质并没有一个跨膜结构域或是内质网滞留信号肽。

内质网蛋白

利用WoLF PSORT和PS-Scan对内质网蛋白进行预测分析。预测的蛋白质包括SignalP4预测的信号肽，PS-Scan预测的内质网靶标多肽是内质网管腔蛋白。此外，如果它们包含一个或多个跨膜结构域，它们也被归类为内质网膜蛋白。

GPI锚定蛋白

信号肽包含的蛋白质被FragAnchor预测为含有GPI锚点，进一步划分为GPI锚定蛋白。蛋白质序列预测到具有信号肽，GPI锚定蛋白能有与质膜或者变为细胞壁的分泌成分结合。

其他亚细胞位置的蛋白质

其他亚细胞位置，包括线粒体、细胞溶液(细胞质)、细胞骨架、高尔基体、溶酶体、细胞核、过氧化物酶体、质膜和液泡的蛋白通过WoLF PSORT来预测。对于预测位于线粒体，高尔基体，细胞核和液泡的蛋白质，如果一个蛋白质包含一个或多个跨膜结构域，它被进一步列为一个膜蛋白在特定的亚细胞定位。

1.3数据库的安装

数据存储在一个Linux服务器MySQL关系数据库。用户界面和模块访问数据采用PHP模式。从主用户界面上的链接http://proteomics.ysu.edu/secretomes/ fungi2/index.php.可以访问BLAST程序以及提交注释信息。补充表和其他数据可以在http://proteomics.ysu.edu/publication/data/FunSecKB2/.下载。

2结果

2.1蛋白质亚细胞定位预测精度的评价

我们采用了上述基于我们以前的计算工具的预测评价方法(Min, 2010; Meinken and Min, 2012; Melhem et al., 2013)。为了进一步评估我们的方法的预测精度，我们从UniProtKB/Swiss-Prot数据库中获得了14884个已经完成注释、具有唯一亚细胞定位信息的蛋白。如果蛋白质有多个亚细胞定位或片段化标签，我们就将其排除在外。基于我们之前的公式算法，我们对预测精度的灵敏度、特异性和MCC系数进行了测量(Min, 2010)。精度结果如表1所示，由于作为阳性蛋白的样本数量太少(＜20)，所以质膜和溶酶体的预测精度并未列入在内。相较于使用单一的工具方法，我们的方法使用多种工具包括SignalP4、WoLF PSORT和Phobius来预测分泌的信号肽，用PS-Scan去除内质网蛋白，TMHMM用于去除膜蛋白，这些方法能够显著提高预测精度(Min, 2010; Meinken and Min, 2012)。在对某一种蛋白质大小进行预测时，预测的高度可能分泌蛋白将会得到一个相对准确的估计，这一方法具有最高的特异性(> 0.99)，有趣的是，假阴性的数量是接近用于评价的数据集的假阳性的数量。包括预测可能为分泌蛋白组其MCC值仅略有下降，的只有少数蛋白条带属于这一类。然而，对于弱可能分泌型蛋白的预测分析需要谨慎对待，因为假阳性的数量远远超过的假阴性数量的减少(表1)。

我们还比较了线粒体蛋白由WoLF PSORT和TargetP预测的准确性。我们发现，其Wolf PSORT预测的MCC值为0.67，TargetP预测的MCC值为0.56。我们也发现了使用所有的预测分析工具增加线粒体蛋白预测的特异性，当同时使用时，MCC值从单一使用WoLF PSORT时的0.93增加到> 0.98。然而，由于预测的敏感度降低，使用的所有的分析工具并不能提高MCC的值。因此，我们选择了WoLF PSORT对线粒体蛋白进行定位。然而，用户应该意识到，如果WoLF PSORT和TargetP预测蛋白都是一种线粒体蛋白，那么这个预测结果要比单一的预测结果可靠得多。

其他亚细胞位置的预测精度存在很大的差异。核蛋白的预测的敏感性值为0.85特异性值为0.71，MCC值为0.53。其他的亚细胞位置包括内质网、高尔基体、液泡、细胞质和过氧化物酶体等的预测精度在MCC值上很低(＜0.4) (表1)。然而，应该指出的是，低的精度所造成的灵敏度也是非常低的，事实上，其特异性却是比较高的(＞0.98)。因此，会有一部分的位于这些亚细胞位置的蛋白是无法检测到的。然而，如果一个蛋白质被预测为位于这样的位置，那么这个预测结果是最有可能是正确的。但是，预测这些真菌蛋白的亚细胞位置的精度仍需要提高。

2.2不同物种的亚细胞蛋白质组分布概况

该数据库包含预测的蛋白质的亚细胞位置信息，来自于16554个真菌物种或品种(株)，其中有189个每个至少有1000条蛋白质序列。物种名称，其中一些可能有一个以上名称，可以在用户界面上看到，方便特定物种的搜索或下载。具有大于1000条蛋白质序列的物种，也可以通过由用户提供的物种名称搜索到。不同真菌中物种的亚细胞蛋白质组的分布情况总结在表2和附表1。表2包括以下的亚细胞位置：分泌蛋白(4类)、线粒体膜和线粒体无膜、细胞溶液(细胞质)、细胞骨架、核膜及核无膜、质膜与糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白。分泌蛋白的种类包括以下类别：原始的分泌、极有可能会分泌、分泌和弱分泌蛋白。其他亚细胞蛋白质的位置信息(包括内质网的膜或腔)、高尔基体(膜或腔)、溶酶体、过氧化物酶体、液泡(膜或无膜)，其他的膜，和其他的位置信息，在附表1中。

基因组大小是易变的，因此，在不同的真菌物种中，蛋白质组的大小也是相当大的。然而，应该指出的是，在数据库中，如表2所示，一个给定的物种的总蛋白不一定是蛋白质组的大小，而是一个从不同物种得到的蛋白质的集合。例如，酿酒酵母的蛋白质组的大小， UniProtKB数据库中只包括6621的蛋白质，但是在我们的数据库中，有79093个蛋白质归类到酿酒酵母的名下，明显说明这些蛋白是来自于多个菌株。基于汇总数据为每个子囊菌门、擔子菌门和微孢子虫评估真菌蛋白的亚细胞分布。有趣的是，我们发现核是最大亚细胞定位位置：子囊菌门有39.2%蛋白质定位在核内，担子菌门有39.2%的蛋白质，在微孢子虫有57.4%的蛋白质定位在核内。线粒体蛋白是另一个大的定位区域：子囊菌门有19.5%的蛋白，担子菌门有21.1%的蛋白，微孢子虫有16.7%的蛋白，分别位于线粒体。约18~21%的蛋白质位于细胞质或细胞质中。在子囊菌门，分泌蛋白组的比例从0.3%到10.5%不等，平均含量为4.6%；担子菌门从1.9%到7.4%不等，平均含量为4.4%；微孢子虫从0.5%到1.7%不等，平均含量为0.9%。然而，这里的分泌蛋白组也是有限的，包括原始的分泌蛋白质和极有可能的分泌蛋白，因此一个数字代表一种蛋白组。包括其他预测的蛋白质，分泌性蛋白和弱分泌性蛋白，分泌蛋白组的大小会显著增大。预测弱可能分泌分泌蛋白的分泌可能规模肯定会明显增加，但也会有假阳性和非分泌型蛋白。

2.3不同真菌的生活史与分泌蛋白组的关系

类似于我们以前FunSecKB的分析工作(Lum and Min, 2011)，在一个物种中分泌蛋白组的大小(y)与蛋白质组的大小高度相关(x) (r= 0.87)，回归方程为y= 0.081×271 (图1)。然而，物种不同的生活方式在分泌蛋白组与分泌蛋白的比例大小存在差异。Lowe和Howlett (2012)研究真菌的生活方式和分泌蛋白组的大小，发现具有双相生活方式的真菌菌有很大比例的分泌蛋白，相较于腐生菌或植物真菌，动物病原体只有少部分的基因被预测具有分泌蛋白。在Lowe和Howlett的工作(2012)中，该组仅用SignalP进行分泌蛋白组的预测，因而，其大小可能超过估计。利用我们在这项工作中收集到的数据，我们研究了真菌的生活方式和其分泌的尺寸之间的关系(图1和附表2)。在数据库中的每个物种的数据包含冗余或重复蛋白的条目，我们只是用UniProt数据库中的蛋白质或完整的蛋白质组数据集做为参考(http://www.uniprot.org/taxonomy/complete-proteome S)。我们收集的物种具有完整的蛋白质组，具有植物或动物病原体、人类的病原体或腐生植物的一种生活方式。其中的一些可能被分为多个类别，这些条目被注释(见补充表2)。根据Lowe和Howlett的报道(2012)，人类和动物的病原体，包括病原微生物和一些杀线虫寄生真菌有一个相对较小的蛋白质组，其大小大多都小于12000条蛋白质序列，其中一些被称为微孢子虫的寄生虫的基因组编码共有2000~4000的蛋白质，不超过1%的会被分泌(图1)。人类/动物的病原体，分泌的蛋白质的比例变化从0.3到7.9%，平均为2.8%。另一方面，植物病原菌和腐生菌有更多的大小从4000到18000个蛋白质和较高程度的分泌蛋白，在腐生菌中从1.3%到7.1%，平均含量为4.2%，植物病原菌从1.7%到10.5%，平均含量为6.3%。显然，这些结果表明，分泌的大小是控制真菌的生活方式的重要决定因素之一。然而，具有相似大小的分泌蛋白组的物种却可能有不同的生活方式，在每个物种中，分泌蛋白组的组成可能扮演着重要的作用，决定了物种的生活方式。

2.4真菌分泌蛋白的功能分析

为了提供所有的真菌分泌蛋白的功能的概述，我们进行了GO分析。分泌蛋白组包括原始和预测很有可能分泌的蛋白，仅仅只是为了在UniProtKB/Swiss-Prot数据库执行BLASTP搜索，E值设定为1e-10。GO注释的信息从Uniprot ID映射数据检索(http://www.uniprot. org/downloads)中获取，再利用GO SlimViewer分析(McCarthy et al., 2006)。分泌组蛋白GO分析产生的生物学过程和分子功能归类于表3。分子功能分类显示，真菌分泌蛋白是由大量的水解酶(约33.7%)、具有离子结合功能的蛋白(约21.1%)、肽酶(15.7%)、氧化还原酶类(14%)和其他的一些酶。真菌分泌的蛋白质参与了超过60个不同的生物过程。主要的生物过程，包括代谢过程(24.6%)、碳水化合物的合成(22%)或脂质代谢过(4%)，以及细胞壁组织的合成(6.4%)、应激反应、小分子和氮代谢等过程，应该指出的是，GO分类只是对没有GO功能注释信息的约54%的预测分泌蛋白进行了功能分布的预测。

我们进一步对预测的分泌真菌蛋白进行功能预测，使用rpSBLAST工具对Pfam数据库进行搜索，E值设定为1e-10。在93430个预测的分泌蛋白中，43953个蛋白序列在Pfam分析中能够匹配，共有880个蛋白质家族进行了检测。真菌中33个高度编码的分泌蛋白家族进行了汇总，如表4所示，其完整的列表可以下载(http://proteomics.ysu.edu/publicaiton/ data/)。真菌中10个高编码分泌蛋白家族有天冬氨酰蛋白酶家族、羧酸酯酶家族、FAD结合结构域、枯草杆菌蛋白酶家族、糖基水解酶家族61、糖基水解酶家族28、糖基水解酶家族18、GMC氧化还原酶、丝氨酸羧基肽酶和糖基水解酶3家族。这些蛋白酶，例如在这里确定的如天冬氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、肽酶和其他蛋白家族对各种生长介质或环境中的基质材料存在的蛋白的协同降解可能是必须的(Druzhinina et al. 2012; Girard et al. 2013)。GO分析和功能结构域的分析结果是一致的，显示这些蛋白主要参与降解复杂的生物分子，包括碳水化合物、蛋白质、脂类和其他分子。

3讨论

我们建立了一个真菌蛋白亚细胞定位数据库并命名为真菌分泌蛋白质组和亚细胞蛋白知识库(FunSecKB2)。与FunSecKB相比，蛋白的总条数从478073增加到了1976832，而真菌种类的数量(包括不同种和不同菌株)从52增加到210。而亚细胞定位也从蛋白质组扩增到包括线粒体、细胞质、细胞骨架、高尔基体、溶酶体、细胞核、过氧化物酶体、质膜和液泡。此外，对于分泌蛋白质组，我们进一步将其细分，极有可能分为极有可能的分泌蛋白、可能的分泌蛋白、弱可能的分泌蛋白。这种细化的分类和其它亚细胞定位将会大大提高在不同物种中进行的亚细胞蛋白质组的比较分析。然而，当在UniProtKB获得蛋白序列后，一些重复的条目也会获得，因此对于一个给定物种的蛋白质组分析，我们需要用到非冗余参考和蛋白质组数据集，这也可以在UniProt上下载到(http://www.uniprot.org/taxonomy/complete-proteomes)。还应注意的是，对于列表中一个给定的物种，如果没有特别指定是哪个菌株或者哪个亚种，那么得到的条目将会包含所有蛋白条。

我们还提供了能搜索所有真菌蛋白或者预测的真菌分泌蛋白数据的BLAST工具，包括能搜索到他们的序列。这有助于鉴别同源蛋白及其可能的亚细胞定位。另外，任何匿名的蛋白序列使用者都能够利用这个预测蛋白亚细胞定位的工具。其它预测蛋白质组的亚细胞定位的有效工具已经由Meinken and Min (2012) 和Caccia等人(2013)总结过了。近来，Cortázar等人(2014)应用了一个web服务器SECRETOOL，它集合了多种预测真菌分泌蛋白质组的工具。其中有些工具跟我们使用的一样，我们期望这个服务器能产生相对可靠的预测结果，它也在近来的蛋白质组预测中起到很好的作用(Cortázar et al., 2013;  Lum and Min, 2011)。此外，另一个可靠的数据库，真菌分泌蛋白质组数据库(FSD)，是用一种不太一样的工具建立而成的，它也可能提供其它一些真菌蛋白的亚细胞定位的信息。

真菌有一套适应周围环境的分泌系统，而环境约束导致的选择压力使得物种进化出各种各样的复杂的蛋白质组(Girad et al., 2013; Alfaro et al., 2014)。由于生活方式的不同，腐生性生物的蛋白质组中主要有水解酶。活体生物既有降解水解酶，；菌根生物既有水解酶、又有生物相容性、转换效应蛋白，死体营养型生物有水解酶和致死蛋白(Girad et al., 2013; Alfaro et al., 2014)。分泌蛋白质组基本包含两类蛋白：大部分是以多糖水解酶为代表的蛋白，例如作用于糖苷键的水解酶。还有一小部分是包括蛋白酶、脂肪酶和氧化还原酶等(表3)。在这项工作中，对蛋白的鉴定仅限于经典的分泌蛋白，如含有蛋白的信号肽和那些包含经典蛋白和无铅分泌蛋白。SecretomeP 是一个被用来预测细菌和哺乳动物的无铅分泌蛋白的工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/) (Bendtsen et al., 2004a)。因为这个工具没有被用过预测真菌的数据，预测的精确性无法评估，因此我们没有用这个工具来处理数据。我们想请真菌研究团队提交下真菌蛋白的亚细胞定位数据，特别是无铅分泌蛋白，而且是有文献中的实验数据支持的数据。对一个物种蛋白质组的计算机预测为实验验证和鉴定不同环境或者培养条件下的分泌蛋白提供了第一步的工作基础(Alfaro et al., 2014)。随着我国出版的植物分泌和亚细胞蛋白数据库 (PlantSecKB) (Lum et al., 2014)，我们期望PlantSecKB2将会为研究团队提供一个有效的全基因组比较分析，为进一步探索真菌分泌蛋白在生物燃料、环境修复和植物人类的病原真菌的防治中的功能发挥作用。

作者贡献

JM完成数据库，DA收集物种的生活方式数据，KA和GZ参与研究方法的研究，XJM和CC构思研究。设计数据处理程序。XJM、JM、DA和CC负责分析数据以及论文的撰写。全体作者同意该文章的出版。

致谢

我们非常感谢Gengkon Lum博士和Feng Yu他们在维护服务器方面做出的工作，Jessica Orr和Stephanie Frazier在分泌蛋白数据的人工获取工作的帮助。

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